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羅氏NimbleGen序列捕獲技術(shù)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組定向測(cè)序

瀏覽次數(shù)：3661　發(fā)布日期：2014-6-4　 來(lái)源：本站　本站原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處
最近在Nature  Protocols雜志上在線(xiàn)發(fā)表的一篇文章1介紹了利用NimbleGen序列捕獲技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組定向測(cè)序，用于RNA研究中基因發(fā)現(xiàn)和表達(dá)定量。
 
RNAseq技術(shù)在基因表達(dá)研究中得到了廣泛的應(yīng)用，可對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行無(wú)偏見(jiàn)的采樣。相比定量PCR可以對(duì)更廣泛的基因同步分析，相比芯片方法RNAseq測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性也更高。然而，真核細(xì)胞的表達(dá)譜具有轉(zhuǎn)錄本數(shù)量眾多、可變剪切情況復(fù)雜，且表達(dá)量高低差異大的特點(diǎn)。RNAseq測(cè)序結(jié)果分散在整個(gè)基因組中，不同基因測(cè)序深度差異顯著，對(duì)轉(zhuǎn)錄水平偏低的轉(zhuǎn)錄本往往測(cè)序深度不足，為進(jìn)行特定基因的可變剪切體拼接及定量研究造成阻礙。
 
而序列捕獲技術(shù)通過(guò)寡合苷酸探針雜交，富集研究所感興趣的基因或基因組區(qū)段，實(shí)現(xiàn)了定向測(cè)序。將此技術(shù)與RNAseq結(jié)合，即對(duì)RNAseq的測(cè)序文庫(kù)先進(jìn)行序列捕獲實(shí)驗(yàn)富集感興趣的轉(zhuǎn)錄本，再進(jìn)行測(cè)序，實(shí)現(xiàn)定向RNAseq或RNA捕獲測(cè)序（CaptureSeq）。這一方法可以提高目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的測(cè)序深度，進(jìn)行靈敏的基因發(fā)現(xiàn)、有效的轉(zhuǎn)錄本組裝和準(zhǔn)確的基因表達(dá)定量。
 
文中介紹的實(shí)驗(yàn)步驟主要包括探針設(shè)計(jì)、捕獲測(cè)序和數(shù)據(jù)分析如轉(zhuǎn)錄本拼接及定量。實(shí)驗(yàn)選用了羅氏NimbleGen探針用于目標(biāo)捕獲。NimbleGen可同時(shí)生產(chǎn)2萬(wàn)種探針，可覆蓋多達(dá)200Mb的基因組中的分散區(qū)域或連續(xù)的區(qū)域，可以應(yīng)對(duì)復(fù)雜的真核生物轉(zhuǎn)錄組。文章指出，在探針設(shè)計(jì)時(shí)，僅針對(duì)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的部分序列設(shè)計(jì)探針，通過(guò)這些探針即可捕獲全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，也可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本中的新外顯子。當(dāng)需對(duì)特定剪切方式的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定向研究時(shí)，可在探針設(shè)計(jì)包括連接兩個(gè)外顯子片段的探針，專(zhuān)門(mén)捕獲這些異構(gòu)體。
 
此外，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了用于質(zhì)控的探針。質(zhì)控探針包括：1. 非轉(zhuǎn)錄的基因間區(qū)的探針，以排除gDNA污染；2. 其他可能造成實(shí)驗(yàn)室污染如大腸桿菌等的序列捕獲探針，以排除實(shí)驗(yàn)室污染；3. 數(shù)個(gè)質(zhì)控基因的探針，可用于進(jìn)行測(cè)序前qPCR富集分析，或用于數(shù)據(jù)分析參數(shù)的測(cè)試；4. 針對(duì)摻入樣本的ERCC RNA設(shè)計(jì)的探針。 ERCC RNA Spike-in standards由92個(gè)in vitro轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本組成，表達(dá)量跨越一個(gè)106的范圍，這一些標(biāo)準(zhǔn)品被摻入到最初的RNA樣品中進(jìn)行捕獲測(cè)序，用于判斷測(cè)序量是否充足，以及計(jì)算捕獲off-target rate。另外，將各轉(zhuǎn)錄本獲得的測(cè)序深度，與ERCC  RNA Spike-in standards的測(cè)序深度比較，可以推算出樣本中各轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量。文章作者指出，這個(gè)方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄水平較低的基因的富集，富集率與基因數(shù)量相關(guān)，如1000個(gè)隨機(jī)選擇的基因預(yù)期55倍富集效率。
 
圖：定向RNAseq測(cè)序（CaptureSeq）實(shí)驗(yàn)流程。摘自：Tim R Mercer et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nature Protocols.2014  doi:10.1038/nprot.2014.058.
 
5微克的總RNA約可生成250ng cDNA文庫(kù)，可將多個(gè)樣本的文庫(kù)混合后根據(jù)Roche NimbleGen的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行捕獲實(shí)驗(yàn)。混合捕獲的實(shí)驗(yàn)方案可以對(duì)大量樣本進(jìn)行低成本的測(cè)序。測(cè)序后的分析步驟包括比對(duì)、拼接、去除非目標(biāo)序列、新基因（外顯子）發(fā)現(xiàn)、定量等。
 
通過(guò)這一實(shí)驗(yàn)，可以對(duì)樣本中特定基因的表達(dá)進(jìn)行研究。該方法既RNASeq相比其他表達(dá)譜研究方法的優(yōu)勢(shì)，又可以進(jìn)行有目的性的、多樣本的研究。尤其在對(duì)于表達(dá)水平中低等的轉(zhuǎn)錄本研究中，可以更好地拼接全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本、發(fā)現(xiàn)新基因以及定量分析。
 
1. Tim R Mercer, Michael B Clark, Joanna Crawford, Marion E Brunck, Daniel J Gerhardt,   Ryan J Taft,       Lars K Nielsen,  Marcel E Dinger,  John S Mattick. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nature Protocols.9, 989–1009 (2014) doi:10.1038/nprot.2014.058.
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