細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒

特別提示：包括細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒
英文名稱：CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：SY0509
產(chǎn)品規(guī)格：500T|1000T

CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit 是基于CFDA, SE對(duì)細(xì)胞進(jìn)行示蹤及增殖檢測(cè)的試劑盒，由CFDA,SE粉末、溶劑及相關(guān)細(xì)胞染色緩沖液組成，該試劑盒主要工作原理為：CFDA, SE具有細(xì)胞膜滲透性，本身不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞后，可被胞漿內(nèi)的酯酶催化生成羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE），后者可發(fā)強(qiáng)烈的綠色熒光，不能穿透細(xì)胞膜，能完好的保留在胞內(nèi)。CFSE還可自發(fā)性并不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合從而偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上，同時(shí)過(guò)量且未被偶聯(lián)的CFDA, SE通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散回到細(xì)胞外培養(yǎng)基內(nèi)，被后續(xù)清洗步驟所清除。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的非分裂細(xì)胞的熒光非常穩(wěn)定，穩(wěn)定標(biāo)記的時(shí)間可達(dá)數(shù)月，因此非常適用于細(xì)胞群落分析。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞的熒光非常均一，優(yōu)于以前使用的其他細(xì)胞示蹤熒光探針如PKH26，并且分裂后的子代細(xì)胞的熒光分配也更均一。在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中，CFSE 標(biāo)記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，熒光強(qiáng)度變?yōu)橛H代細(xì)胞的一半，通過(guò)流式細(xì)胞儀（FL1通道）根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，可檢測(cè)出未分裂細(xì)胞，分裂一次（1/2的熒光強(qiáng)度），二次（1/4的熒光強(qiáng)度），三次（1/8的熒光強(qiáng)度），以及更多分裂次數(shù)的細(xì)胞。CFSA，SE可檢測(cè)分裂次數(shù)多達(dá)八次甚至更多。經(jīng)CFDA, SE標(biāo)記的細(xì)胞可用于體外和體內(nèi)增殖研究，且具有不會(huì)使鄰近細(xì)胞染色的功能。CFDA, SE最常用于淋巴細(xì)胞的增殖檢測(cè)，也可用于成纖維細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，造血祖細(xì)胞等其他細(xì)胞的增殖檢測(cè)。

CFDA, SE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，Ex=494nm，Em=521nm，除了流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖外，還可用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察。

本品為CFDA，SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒，包含配制CFDA，SE儲(chǔ)存液所需的溶劑和細(xì)胞標(biāo)記用的染色緩沖液，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備工作。另，CFDA,SE標(biāo)記細(xì)胞一般15min即可完成，對(duì)于不同細(xì)胞，需要自行摸索最佳標(biāo)記時(shí)間。按照每個(gè)樣本的標(biāo)記體積為2ml計(jì)算。

注意事項(xiàng)
1）CFDA,SE易被水解，在水溶液中會(huì)很快變質(zhì)。因此保存過(guò)程中粉末或者儲(chǔ)存液都需干燥保存；而且使用過(guò)程中避免接觸水。但在標(biāo)記細(xì)胞的過(guò)程中和水接觸是在許可范圍內(nèi)的。
2）CFDA,SE溶劑在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，于20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后方可使用。
3）不同的細(xì)胞其細(xì)胞內(nèi)酯酶活性不同，因此染色效果具有差異性。
4）雖然本試劑盒已對(duì)CFDA,SE染色體系做了優(yōu)化處理，但建議使用者根據(jù)自身的細(xì)胞類型，培養(yǎng)條件以及應(yīng)用的不同來(lái)梯度摸索最佳的工作濃度，以最低濃度得到適宜的標(biāo)記效率為準(zhǔn)。
5）熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，染色過(guò)程需盡量避光。
6）為了您的健康，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服和帶一次性手套。

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期1年

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貨號(hào)	名稱	規(guī)格
YT136	一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(紅色熒光)	20次|50次
YT897	細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)	100次|500次
YT898	碘化丙啶	5mg|20mg
SNM518	DNA ladder 3000	60T
KFS198	Caspase 3分光光度法檢測(cè)試劑盒	20T|50T|100T
KFS317	XTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑	500T|1000T

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名稱：細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(乳酸脫氫酶法)
貨號(hào)：YT125
規(guī)格：100次|500次
本試劑盒也稱乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)試劑盒(LDH Release Assay Kit)，是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應(yīng)，通過(guò)比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性時(shí)釋放的乳酸脫氫酶活性或檢測(cè)其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。

本試劑盒可以用于常規(guī)的乳酸脫氫酶活性的檢測(cè)，更常用于以LDH釋放為指標(biāo)的細(xì)胞毒性檢測(cè)。同時(shí)，基于細(xì)胞總?cè)樗崦摎涿富钚缘臋z測(cè)，本試劑盒也可以用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)。

細(xì)胞凋亡或壞死而造成的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)。通過(guò)檢測(cè)從質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，并被廣泛用于細(xì)胞毒性檢測(cè)。LDH釋放被認(rèn)為是以前使用放射性的51Cr標(biāo)記細(xì)胞，隨后通過(guò)51Cr釋放進(jìn)行細(xì)胞膜完整性檢測(cè)的安全有效的替代方法。

本試劑盒的基本原理是，在乳酸脫氫酶的作用下，NAD+被還原生成NADH，NADH和INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應(yīng)生成NAD+和強(qiáng)生色物甲臜(formazan)，在490nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰，從而可以通過(guò)比色來(lái)定量乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關(guān)。該酶聯(lián)反應(yīng)原理的示意圖如下：



試劑盒組份（100次為例）：
LDH釋放試劑——————1.5ml
乳酸溶液———————2ml
酶溶液————————1ml×2
INT溶液(10X)—————0.2ml
INT稀釋液——————2ml

注意事項(xiàng)：
1.冷凍會(huì)使樣品中部分乳酸脫氫酶失活，4℃可放置2-3天。建議樣品準(zhǔn)備好后盡量當(dāng)天完成測(cè)定。
2.如果檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶，由于血清含有乳酸脫氫酶，建議血清的使用濃度不要超過(guò)1%，并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清，在檢測(cè)時(shí)一定要設(shè)置沒(méi)有細(xì)胞，但加入了相同體積培養(yǎng)液的對(duì)照孔，以用于消除背景。
3.細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)、密度過(guò)高、離心速度過(guò)大、培養(yǎng)箱內(nèi)外溫差過(guò)大，都會(huì)造成細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶增加。
4.如果希望進(jìn)行乳酸脫氫酶活性的絕對(duì)定量，用戶需自備乳酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)品。

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期一年。

使用方法：

一、樣品的準(zhǔn)備：
方法一：LDH釋放檢測(cè)
a.根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80-90%滿。
b.吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o(wú)血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的對(duì)照細(xì)胞孔(樣品對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品最大酶活性對(duì)照孔)，以及藥物處理的細(xì)胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標(biāo)記。按照實(shí)驗(yàn)需要給予適當(dāng)藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時(shí)間，對(duì)照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇��?duì)照)，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品最大酶活性對(duì)照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。
c.到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。
方法二：細(xì)胞內(nèi)總LDH的檢測(cè)
a.細(xì)胞毒性檢測(cè)：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80-90%滿。加入不同藥物進(jìn)行處理，并設(shè)置適當(dāng)對(duì)照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl 用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃培養(yǎng)板混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。
b.細(xì)胞增殖檢測(cè)：根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥物刺激后細(xì)胞不超過(guò)80-90%滿為宜。使用不同的藥物刺激細(xì)胞，并設(shè)置適當(dāng)對(duì)照。藥物刺激完畢后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。盡量吸除上清，加入150μl 用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻)，適當(dāng)搖晃混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。
  注：LDH釋放檢測(cè)更加常用一些，細(xì)胞內(nèi)總LDH檢測(cè)通�？梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。

二、試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a.INT溶液(1X)的配制：根據(jù)所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀釋液，混勻后即配置為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配置后4℃保存可于當(dāng)天使用，不宜配置后凍存。
b.LDH檢測(cè)工作液的配置:根據(jù)待測(cè)定的樣品數(shù)(含對(duì)照)，參考下表在臨檢測(cè)前新鮮配制適量的檢測(cè)工作液。
  注意：LDH檢測(cè)工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過(guò)程中均要注意適當(dāng)避光。
  

檢測(cè)次數(shù)	1次	10次	20次	50次
乳酸溶液	20μL	200μL	400μL	1mL
INT溶液(1X)	20μL	200μL	400μL	1mL
酶溶液	20μL	200μL	400μL	1mL
總體積	60μL	600μL	1.2mL	3mL

c.(選做)如果希望進(jìn)行LDH酶活性的絕對(duì)定量，需自備LDH標(biāo)準(zhǔn)品，并新鮮配制不同濃度LDH標(biāo)準(zhǔn)品，如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、0.65mU/ml、0 mU/ml。

三、樣品測(cè)定：
a.各孔分別加入60μl LDH檢測(cè)工作液。
b.混勻，室溫(約25℃)避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng))。然后在490nm處測(cè)定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。
c.計(jì)算(測(cè)得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對(duì)照孔吸光度)
d.細(xì)胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度)×100
e.可繪制細(xì)胞毒性曲線：縱座標(biāo)為實(shí)際吸光度，橫坐標(biāo)為藥物濃度；據(jù)此可計(jì)算該藥物作用特定時(shí)間的半致死劑量LD50。

附錄1：
可同時(shí)測(cè)定一已知濃度的LDH酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度值，參考以下公式粗略計(jì)算出樣品中LDH酶活力：
待測(cè)樣品中LDH活力單位(mU/ml)＝(樣品孔吸光度－背景空白對(duì)照孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mU/ml)；
根據(jù)計(jì)算結(jié)果可以比較不同樣品處理組間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異等。

附錄2：
若需準(zhǔn)確計(jì)算出LDH酶活性的絕對(duì)活性，可通過(guò)一系列LDH標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)測(cè)得的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)公式計(jì)算出樣品中LDH的酶活性。
各孔數(shù)值減去空白對(duì)照后，以檢測(cè)的吸光度(OD490)為縱坐標(biāo)，LDH酶活力(mU)為橫坐標(biāo)，繪制LDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)計(jì)算出該趨勢(shì)線的公式。