羊闊盤吸蟲熒光定量PCR試劑盒(染料法)

特別提示：包括羊闊盤吸蟲熒光定量PCR試劑盒(染料法)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：羊闊盤吸蟲熒光定量PCR試劑盒(染料法)
英文名稱：Eurytrema ovis qPCR Kit(Dye Method)
產(chǎn)品貨號(hào)：BTN14-51320
產(chǎn)品規(guī)格：50次



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名稱：豬鉤端螺旋體病(LPP)單重?zé)晒釶CR檢測試劑盒
貨號(hào)：SYA437
規(guī)格：48次/盒|96次/盒
一、簡介：
本試劑盒用一對(duì)鉤端螺旋體特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對(duì)鉤端螺旋體的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

二、用途
本試劑盒適用于檢測動(dòng)物內(nèi)臟、血液等樣本中的鉤端螺旋體，用于鉤端螺旋體感染的輔助診斷，其檢測結(jié)果僅供參考。

三、試劑盒組成：

組份	數(shù)量	規(guī)格
Lep反應(yīng)液(Lep-qPCR MIX)	1管	672μL/管
核酸提取液(DNA Extraction)	2管	1.5mL/管
酶混合物(Enzymes MIX)	1管	48μL/管
陰性對(duì)照(NTC)	1管	50μL/管
Lep陽性對(duì)照(Lep-PTC)	1管	50μL/管

四、儲(chǔ)存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為12個(gè)月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與DNA提取
6.1 樣品的采集
病死動(dòng)物取心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等組織1g；活動(dòng)物用無菌注射器抽取3～5mL 血液。
6.2 樣品前處理
每份組織分別從3個(gè)不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.05g于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液 100μL于 1.5mL滅菌離心管中；血液樣本：取抗凝血下層血細(xì)胞 50μL，加入 100μL 雙蒸水吹勻。
6.3 DNA提取
6.3.1 對(duì)上述處理好的樣本加入等體積核酸提取液(固體標(biāo)本加入50μL核酸提取液)，100℃恒溫處理10min，13000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管，-20℃保存；
6.3.2 DNA的提取也可以采用商業(yè)化DNA提取試劑盒。
 注：陽性對(duì)照和陰性對(duì)照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL加入到反應(yīng)體系中即可。由于陽性對(duì)照濃度較高，建議最后在樣品制備區(qū)域加入陽性對(duì)照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(Lep-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑	每個(gè)反應(yīng)加入的量	N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液	14μL	N×14μL
酶混合物	1 μL	N×1 μL
總量	15 μL	N×15μL

計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(Lep-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。推薦循環(huán)條件：

	1循環(huán)	50℃ for 2 min
預(yù)變性	1循環(huán)	95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增	40循環(huán)	95℃ for 15 sec 60℃ for 60 sec

在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào) 。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

八、結(jié)果分析：
8.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果�；�線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。
8.2 試驗(yàn)成立判定
（1）陰性對(duì)照(NTC)：不應(yīng)產(chǎn)生任何的擴(kuò)增曲線。
（2）陽性對(duì)照(Lep-PTC)：均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。
（3）以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則，此次試驗(yàn)視為無效。
8.3 結(jié)果判定
(1)在試驗(yàn)成立的條件下，Ct值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線，表明Lep核酸陽性。
（2）Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明Lep核酸陰性。
（3）如果Ct值>35，判為可疑樣品。對(duì)于可疑樣品，先看擴(kuò)增曲線。如果擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
（4）對(duì)于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進(jìn)行Lep 檢測。如果重復(fù)擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，判為樣本陽性，表明Lep核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項(xiàng)：
（1）初次使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。并嚴(yán)格按照說明書步驟操作。
（2）所有使用的離心管最好高壓滅菌，而且必須不含DNA酶。
（3）PCR操作應(yīng)嚴(yán)格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)等)，防止實(shí)驗(yàn)室污染。
（4）樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以免污染。
（5）試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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