構(gòu)巢曲霉熒光定量PCR試劑盒(染料法)

特別提示：包括構(gòu)巢曲霉熒光定量PCR試劑盒(染料法)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：構(gòu)巢曲霉熒光定量PCR試劑盒(染料法)
英文名稱：Aspergillus nidulans qPCR Kit(Dye Method)
產(chǎn)品貨號：BTN14-26730
產(chǎn)品規(guī)格：50次



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名稱：豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)單重?zé)晒釶CR檢測試劑盒
貨號：SYA405
規(guī)格：48次/盒|96次/盒
一、簡介：
本試劑盒用一對豬藍(lán)耳病病毒通用特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對豬藍(lán)耳病病毒RNA進(jìn)行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。本試劑盒中豬藍(lán)耳病病毒通用的探針報告基團(tuán)為FAM。

二、用途：
本試劑盒適用于豬病料、鼻咽拭子、血液等樣本中的豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)特異性檢測，適用于豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV)感染的輔助診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，其檢測結(jié)果僅供臨床參考。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數(shù)量 規(guī)格
豬藍(lán)耳病病毒通用熒光qRT-PCR反應(yīng)液(PRRSV-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對照(NTC) 1管 50μL/管
陽性對照(PRRSV-PTC) 1管 50μL/管

四、儲存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。

六、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)采集。標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-80℃，但不能超過6個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用0℃冰壺。
6.1.1 血清：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入無菌的干燥玻璃管，室溫(22-25℃)放置30-60min，血標(biāo)本可自發(fā)完成凝集析出血清，或直接使用水平離心機，3000rpm離心5min，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.2 血漿：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)或檸檬酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5-10min后即可分離出血漿，轉(zhuǎn)移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.3 拭子、分泌物等樣品：在裝有拭子或分泌物的離心管中加入500µL PBS或生理鹽水，劇烈振蕩30s。棉拭子盡量擠出液體轉(zhuǎn)移到無RNA酶污染的離心管中，6000rpm離心20s，取上清備用。
6.1.4 病灶組織樣品：稱取組織約0.1g于研磨器或組織勻漿器中研磨(最好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理鹽水研磨至無塊狀物，然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液于1.5mL滅菌離心管中。
6.2 RNA提取
可采購北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行操作。
 注：陽性對照和陰性對照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5µL加入到反應(yīng)體系中即可。由于陽性對照濃度較高，建議最后在樣品制備區(qū)域加入陽性對照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR反應(yīng)液(PRRSV-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1µL
總量 15µL N×15µL
計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品/陰性對照(NTC)/陽性對照(PRRSV-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qRT-PCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入實時熒光PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription) 1循環(huán) 45℃ for 10 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃ 延伸時收集熒光信號。報告基團(tuán)：設(shè)置為FAM，淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX 參比熒光。

八、結(jié)果分析：
8.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果�；�線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準(zhǔn)。
8.2 試驗成立判定
（1） 陰性對照(NTC)：不應(yīng)產(chǎn)生任何的擴增曲線。
（2） 陽性對照(PRRSV-PTC)：均產(chǎn)生擴增曲線。
（3） 以上條件應(yīng)同時滿足，否則，此次試驗視為無效。
8.3 結(jié)果判定
（1） 在試驗成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明PRRSV核酸陽性。
（2） Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明PRRSV核酸陰性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對于可疑樣品，先看擴增曲線。如果擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
（4） 對于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進(jìn)行PRRSV qRT-PCR檢測。如果重復(fù)擴增曲線為對數(shù)擴增曲線，判為樣本陽性，表明PRRSV核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項：
（1） 初次使用前請仔細(xì)閱讀說明書。并嚴(yán)格按照說明書步驟操作。
（2） 所有使用的離心管最好高壓滅菌，而且必須不含RNA酶。
（3） PCR操作應(yīng)嚴(yán)格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、PCR擴增區(qū)等)，防止實驗室污染。
（4） 樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺進(jìn)行，以免污染。
（5） 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。


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