鰓霉屬PCR試劑盒

特別提示：包括鰓霉屬PCR試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱(chēng)：鰓霉屬PCR試劑盒
英文名稱(chēng)：Branchiomyce spp. PCR Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：BTN13-89500
產(chǎn)品規(guī)格：50次



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名稱(chēng)：禽流感病毒H3亞型(AIV-H3)單重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒
貨號(hào)：SYA384
規(guī)格：48次/盒
一、簡(jiǎn)介：
本試劑盒用一對(duì)禽流感病毒H3亞型特異性引物，結(jié)合特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)禽流感病毒H3亞型RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。本試劑盒中禽流感病毒H3亞型的探針報(bào)告基團(tuán)為HEX/VIC/JOE。

二、用途：
本試劑盒適用于鼻咽提取物、鼻咽拭子、支氣管肺泡灌洗液等臨床樣品中禽流感病毒H3亞型的特異性檢測(cè)。適用于禽流感病毒H3亞型感染的輔助診斷、監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查，其檢測(cè)結(jié)果僅供參考。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數(shù)量 規(guī)格
禽流感H3熒光qRT-PCR反應(yīng)液(H3-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
無(wú)核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對(duì)照(NTC) 1管 50μL/管
陽(yáng)性對(duì)照(H5-PTC) 1管 50μL/管

四、儲(chǔ)存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個(gè)月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測(cè)儀等。

六、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)采集。標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-80℃，但不能超過(guò)6個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。
6.1.1 血清：用一次性無(wú)菌注射器抽取靜脈血2mL，注入無(wú)菌的干燥玻璃管，室溫(22-25℃)放置30-60min，血標(biāo)本可自發(fā)完成凝集析出血清，或直接使用水平離心機(jī)，3000rpm離心5min，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.2 血漿：用一次性無(wú)菌注射器抽取靜脈血2mL，注入含EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)或檸檬酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5-10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，5-10min后即可分離出血漿，轉(zhuǎn)移至1.5mL滅菌離心管。
6.1.3 拭子、分泌物等樣品：在裝有拭子或分泌物的離心管中加入500μL PBS或生理鹽水，劇烈振蕩30s。棉拭子盡量擠出液體轉(zhuǎn)移到無(wú)RNA酶污染的離心管中，6000rpm離心20s，取上清備用。
6.1.4 病灶組織樣品：稱(chēng)取組織約0.1g于研磨器或組織勻漿器中研磨(最好置于冰上或加入液氮)，再加1mL生理鹽水研磨至無(wú)塊狀物，然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液于1.5mL滅菌離心管中。
6.2 RNA提取
可按常規(guī)方法提取，也可采用商品化試劑盒提取病毒RNA。
6.2.1 取無(wú)RNA酶的1.5 mL Eppendorf離心管，做好標(biāo)識(shí)。
6.2.2 加入600 μL裂解液，200 μL樣本，200 μL氯f(wàn)ǎng，混勻器上振蕩5 s，4℃ 12000 rpm離心15 min。
6.2.3 吸取步驟6.2.2中的上清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的1.5 mL Eppendorf離心管中(避免吸出中間層)，加入400 μL異丙醇，顛倒混勻。
6.2.4 4℃ 12000 rpm離心15 min，棄上清；加入600 μL 75％乙醇。
6.2.5 4℃ 12000 rpm離心10 min，棄上清。打開(kāi)離心管管蓋，室溫干燥5 min-10 min。
6.2.6 加入10μL 無(wú)核酸酶水，溶解管底的RNA，5000 rpm離心5 s，-20℃保存。若長(zhǎng)期保存需放置-80℃冰箱。
 注：陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照為已經(jīng)抽提好的核酸(無(wú)需提取)，直接取5µL加入到反應(yīng)體系中即可。由于陽(yáng)性對(duì)照濃度較高，建議最后在樣品制備區(qū)域加入陽(yáng)性對(duì)照。

七、檢測(cè)步驟：
7.1 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR反應(yīng)液(H3-qRT-PCRMIX)、酶混合物(EnzymesMIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合液 1µL N×1µL
總量 15µL N×15µL
計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL，向每管中加入處理后樣品/陰性對(duì)照(NTC)/陽(yáng)性對(duì)照(H3-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qRT-PCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription) 1循環(huán) 45℃ for 10 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為HEX/VIC/JOE，淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

八、結(jié)果分析
8.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測(cè)結(jié)果。基線(xiàn)和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線(xiàn)的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。
8.2 試驗(yàn)成立判定
(1)陰性對(duì)照(NTC)：不應(yīng)產(chǎn)生任何的擴(kuò)增曲線(xiàn)。
(2)陽(yáng)性對(duì)照(H3-PTC)：均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(xiàn)。
(3)以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足，否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。
8.3 結(jié)果判定
(1)在試驗(yàn)成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽(yáng)性，表明H3核酸陽(yáng)性。
(2)Ct值顯示為無(wú)的樣本為陰性樣本，表明H3核酸陰性。
(3)如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對(duì)于可疑樣品，先看擴(kuò)增曲線(xiàn)。如果擴(kuò)增曲線(xiàn)為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線(xiàn)，則為可疑陽(yáng)性，否則判為陰性。
(4)對(duì)于可疑陽(yáng)性樣品，重新抽提核酸，再次進(jìn)行H3qRT-PCR檢測(cè)。如果重復(fù)擴(kuò)增曲線(xiàn)為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線(xiàn)，判為樣本陽(yáng)性，表明H3核酸陽(yáng)性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項(xiàng)：
(1)初次使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。并嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作。
(2)所有使用的離心管最好高壓滅菌，而且必須不含RNA酶。
(3)PCR操作應(yīng)嚴(yán)格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)等)，防止實(shí)驗(yàn)室污染。
(4)樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以免污染。
(5)試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。


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