DAB法顯色試劑盒(小鼠IgG)

特別提示：包括DAB法顯色試劑盒(小鼠IgG)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：DAB法顯色試劑盒(小鼠IgG)
英文名稱：Western Blotting Mouse IgG DAB Chromogenic Reagent Kit
產(chǎn)品貨號：QN1162
產(chǎn)品規(guī)格：1盒

本試劑盒主要用于western blotting的DAB顯色，含有抗小鼠IgG酶標二抗。

SDS-PAGE電泳后，蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測電泳分離的特異性的蛋白。

試劑盒組分：
封閉試劑————————————30g
10倍濃縮抗體稀釋液———————50ml
酶標二抗————————————0.5ml，效價1:500～3000
20倍DAB濃縮顯色液-———————5mlA+5mlB。

常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜后:
1) 清洗轉(zhuǎn)印膜：將膜剝離下后，作好標記，一般在左上角剪一缺口。室溫用TBS-T 漂洗3 次每次5min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。
2) 按5g 封閉試劑加100ml 雙蒸水計，配制膜封閉液，配好的膜封閉液為乳白色懸液，將漂洗過的轉(zhuǎn)印膜，封閉液內(nèi)，搖床震動，室溫封閉30min。用TBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗3 次每次5min。
3) 將10×抗體稀釋液用雙蒸水稀釋成1×（10ml 10×抗體稀釋液加入90ml 雙蒸水，混勻，可4℃保存三個月）。此稀釋液可作為一抗和二抗的稀釋液。
4) 用1×的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量以及一抗的推薦稀釋濃度來稀釋一抗。將雜交膜放入雜交袋中，加入一抗工作液，封口，4℃孵育過夜或37℃搖動孵育2h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。注：如果所加一抗不同，可在此步將膜沿電泳方向剪成條，分別作好標記，分開孵育。
5) 用TBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗3 次每次5min。
6) 用稀釋好的抗體稀釋液稀釋抗體。根據(jù)用量，按10ml 抗體稀釋液加入10ul HRP 標記二抗的比例，配制二抗工作液。將雜交膜放入雜交袋中，加入二抗工作液，封口， 37℃搖動孵育1h。此用過的抗體一般可回收第二天再使用一次。
7) 用TBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗3 次每次10min。
8) 配制DAB 顯色：根據(jù)用量，取TBS-T 4ml，加入DAB 顯色液A、DAB 顯色液B 各200ul，混勻，加在膜正面，室溫下顯色。在目標條帶顯出后，而且背景未出時，放入水中終止顯色。

注意事項：
1. 請根據(jù)一抗來源選擇試劑盒。
2. western blotting DAB顯色法操作簡單，但其敏感性與ECL發(fā)光發(fā)有一定的差距，一般只適用于豐度較高的蛋白。
3. 可以根據(jù)顯色結(jié)果來優(yōu)化實驗反應(yīng)時間。如背景過深，可延長膜封閉時間，加長最終漂洗次數(shù)與時間。如果條帶過弱，可延長抗體孵育時間。
4. 如果完全沒有條帶，請檢查前期蛋白處理及實驗過程， 如果確認無誤，反復(fù)兩次依舊無結(jié)果，請換用ECL發(fā)光法顯色。
5. TBS-T（0.01M）配制方法：稱取NaCl 8.5g ，Tris 1.21g ，用800ml 的雙蒸水溶解，用鹽酸調(diào)PH 到7.6，再加入0.5ml Tween－20，用雙蒸水加至1000ml，混勻即可。（也可按照自己的配制習(xí)慣來配制）

儲存條件：-20℃避光，有效期一年。

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名稱：SDS-PAGE凝膠制備試劑盒
貨號：WE0293
規(guī)格：40-60 gels|200-300 gels
  本試劑盒包括SDS-PAGE凝膠制備所需全套試劑，只需自備蒸餾水，即可制備高質(zhì)量各種濃度的變性PAGE凝膠，方便、快捷。本試劑盒在分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液中已加入10%SDS,使用時不用另外加入。

試劑盒組成：

組份	40-60 gels	200-300 gels
30%Acr-Bis(29:1)	100ml	2×250ml
SDS-PAGE Separating Gel Buffer(4×)	100ml	500ml
SDS-PAGE Stacking Gel Buffer(4×)	50ml	250ml
APS	0.5 g	2.5 g
TEMED	1ml	5 m l

本產(chǎn)品所提供的APS(過硫酸銨)為固體粉末，使用前加入純水溶解即配制成10%APS溶液(0.5 g APS加5ml純水、2.5 g APS加25ml純水)，將溶液分裝后置于-20℃保存，通常半年內(nèi)有效。溶液在使用中可放置4℃保存兩周。

注意事項：
1、10%APS配制后分裝-20度保存。APS溶液不穩(wěn)定，應(yīng)盡量減少室溫存放時間，每次取用后立即放回冰箱，以防失效；若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時間延長，應(yīng)考慮更換使用-20度保存的10%APS。
2、PAGE凝膠的凝聚速度與溫度以及APS、TEMED的用量密切相關(guān)；在其它條件不變的情況下，可通過改變APS及TEMED的用量，控制PAGE凝膠的聚合速度，凝膠聚合過快不利于操作；附表中的APS及TEMED量可供參考，應(yīng)根據(jù)實際操作情況做適當?shù)恼{(diào)整。
3、在凝膠配制過程中，尤其是液體混勻步驟，應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生。
4、在分離膠上層加純水時要小心操作，加水時速度不能太快。
5、具有神經(jīng)毒性，操作時請穿著實驗服并佩戴一次性手套。
6、本產(chǎn)品僅用于科研，不能用于人體實驗或人體治療。

操作步驟：
根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適的PAGE分離膠配制濃度，最佳膠濃度請參考附表1。

I 灌制分離膠(各試劑使用量請參考附表2)
1．參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
注：加入上層篩板有助于加樣時保持填料與樣品均勻接觸，是否加入上層篩板可根據(jù)實際情況選擇。
2．將不同體積的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Separating Gel Buffer和純水在小燒杯或試管中混合。
3．加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
4．在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可)， 然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
5．靜置30-60分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，表面凝膠已聚合。

II 灌制濃縮膠(各試劑使用量請參考附表3)
1、去除覆蓋在分離膠上的水層。
2、將不同體積的30%Acr-Bis(29:1)、SDS-PAGE Stacking Gel Buffer和純水在一個小燒杯或試管中混合。
3、加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
4、將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。
5、將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
6、靜置10~20分鐘，等待濃縮膠聚合。
7、待凝膠聚合后，小心地拔出梳子，以免破壞加樣孔。
8、進行常規(guī)電泳操作。

附表1. SDS-PAGE分離膠的濃度與最佳分離范圍

SDS-PAGE 分離膠濃度	最佳分離范圍
6%膠	50-150 kD
8%膠	30-90 kD
10%膠	20-80 kD
12%膠	12-60 kD
15%膠	10-40 kD

附表2. 配制SDS-PAGE分離膠

分離膠濃度	凝膠體積	所需各組分體積(單位：ml)
		純水	30%Acr-Bis(29:1)	SDS-PAGE Separating Gel Buffer(4×)	10%APS	TEMED
6%	5ml	2.75	1.0	1.25	0.05	0.004
	10ml	5.5	2.0	2.5	0.1	0.008
	15ml	8.25	3.0	3.75	0.15	0.012
	20ml	11	4.0	5	0.2	0.016
8%	5ml	2.42	1.33	1.25	0.05	0.003
	10ml	4.8	2.7	2.5	0.1	0.006
	15ml	7.25	4.0	3.75	0.15	0.009
	20ml	9.7	5.3	5	0.2	0.012
10%	5ml	2.08	1.67	1.25	0.05	0.002
	10ml	4.17	3.33	2.5	0.1	0.004
	15ml	6.25	5.0	3.75	0.15	0.006
	20ml	8.3	6.7	5	0.2	0.008
12%	5ml	1.75	2.0	1.25	0.05	0.002
	10ml	3.5	4.0	2.5	0.1	0.004
	15ml	5.25	6.0	3.75	0.15	0.006
	20ml	7.0	8.0	5	0.2	0.008
15%	5ml	1.25	2.5	1.25	0.05	0.002
	10ml	2.5	5.0	2.5	0.1	0.004
	15ml	3.75	7.5	3.75	0.15	0.006
	20ml	5	10.0	5	0.2	0.008

附表3. 配制5%SDS-PAGE濃縮膠

凝膠體積	所需各組分體積(單位：ml)
	純水	30%Acr-Bis(29:1)	SDS-PAGE Stacking Gel Buffer(4×)	10%APS	TEMED
2ml	1.14	0.34	0.5	0.02	0.002
4ml	2.28	0.68	1	0.04	0.004
6ml	3.42	1.02	1.5	0.06	0.006
8ml	4.56	1.36	2	0.08	0.008

儲存條件：2～8℃

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貨號	名稱	規(guī)格
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SNM427	DAB顯色試劑盒(20×)	60ml|20ml
SNM446	麗春紅染色液	100ml
SNM464	Western Blot檢測試劑盒	20T|10T
RFT045	超低分子量蛋白Marker I(3.3～22KD)	10T(100μl)
QN1086	Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒	25T|50T|100T