特別提示:包括大鼠YWHAZ內(nèi)參引物(10μM)在內(nèi),本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
產(chǎn)品名稱:大鼠YWHAZ內(nèi)參引物(10μM)
英文名稱:Rat YWHAZ Endogenous Reference Genes Primers, 10 μM
產(chǎn)品貨號:GS2346
產(chǎn)品規(guī)格:100μl
儲存條件:冷凍(-20℃)
概述
實時熒光定量PCR(定量PCR)技術(shù)能夠非常靈敏的對核酸進行定量。在研究不同細胞類型,發(fā)育階段,和/或樣品處理時,內(nèi)源性參照基因的選擇就至關(guān)重要。我司根據(jù)GenBank上公布的序列,通過BLAST搜索和實驗驗證,推出了高特異性的15對大鼠內(nèi)源性參照基因的引物。使用此內(nèi)參引物可以獲得更為準確的靶基因表達結(jié)果
特點
- 擴增長度:50-200 bp;
- 引物長度:19-27核苷酸;
- GC含量:40-60%;
- 退火溫度:60°c
- 特異性:全部引物均通過與全mRNA RefSeq數(shù)據(jù)庫BLAST比對設(shè)計并經(jīng)實驗驗證。
應(yīng)用
熒光定量PCR內(nèi)參
組份
RN-YWHAZ
根據(jù)您的關(guān)注的
大鼠YWHAZ內(nèi)參引物(10μM)(40-60%),您可能還對以下產(chǎn)品有需求:
名稱:可調(diào)式易錯PCR試劑盒
貨號:BTN160903
規(guī)格:100次
易錯PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校對功能的特性,在一定條件下(如不同的dNTP濃度、Mg濃度和MnCl2存在)能夠按較高的機率引入隨機引入突變。如果有適當(dāng)?shù)倪x擇方法,則可從構(gòu)建的突變庫選出所需突變體。易錯PCR和常規(guī)PCR的比較如下:
產(chǎn)品特點:
1. 即開即用,十分簡單方便,尤其在生物制藥和酶學(xué)研究領(lǐng)域顯示出了它的優(yōu)越性。
2. 配方經(jīng)過精心優(yōu)化,實驗人員在一定范圍內(nèi)可以控制突變率,一輪PCR的突變率范圍在2-8突變/1000bp,更高的突變率可以通過多輪PCR達到。
3.可用于連續(xù)易錯PCR,只需把上一次易錯PCR的產(chǎn)物用作下一次易錯PCR的模板即可,使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。
4.可以擴增的DNA片段更長,達到3kb,對于3kb以上的產(chǎn)物,建議分段擴增。
試劑盒組成:
成分 |
規(guī)格 |
Taq DNA聚合酶(5U/μL) |
100μl |
易錯PCR專用dNTP 2.0,10× |
300μl |
易錯PCR Mix 2.0,10× |
300μl |
易錯PCR專用MnCl2 |
300μl |
易錯PCR專用dGTP |
300μl |
超純水 |
1ml |
儲存條件:低溫運輸,-20℃保存,有效期為一年。
使用方法:
1. 將模板DNA稀釋到1ng/uL。將引物稀釋到10uM。
注意:引物是決定易錯PCR成敗的關(guān)鍵因素,設(shè)計引物時要保證其Tm在70℃,長度在25-30nt之間,GC含量在45%-60%之間,3端GC含量低,并且沒有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
2. 根據(jù)每1000bp的預(yù)期突變數(shù)按下表確定易錯PCR的反應(yīng)條件中MnCl2和dGTP的用量。表中的A表示易錯PCR專用的MnCl2,B表示易錯PCR專用的dGTP:
預(yù)期突變數(shù) |
2個 |
3個 |
4個 |
5個 |
6個 |
7個 |
8個 |
A的用量(μl) |
0 |
1.0 |
2.5 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
B的用量(μl) |
0 |
0 |
0 |
1.0 |
2.0 |
3.0 |
4.0 |
3.以30μL的標準PCR反應(yīng)體系為例,如果反應(yīng)體系不是30μL,各成分需要按等比例增加或減少。在一干凈的PCR管中,加入下列成分
注意:可以先計算出超純水的用量,優(yōu)先加水
成分 |
用量 |
超純水 |
根據(jù)第2步加 |
易錯PCR Mix,10× |
3μl |
易錯PCR 專用dNTP,10× |
3μl |
易錯PCR 專用MnCl2 |
根據(jù)上步 |
易錯PCR 專用dGTP |
根據(jù)上步 |
自備DNA模板(1ng/μl) |
1μl |
自備PCR引物(10μM each) |
1μl each |
Taq DNA聚合酶(5U/μl) |
1μl |
4. 按已經(jīng)優(yōu)化的PCR條件進行一定循環(huán)數(shù)的PCR(循環(huán)數(shù)與突變率的關(guān)系見下表),然后取5μL電泳檢查。如果沒有優(yōu)化的PCR條件,一般可以先嘗試下面的PCR條件(對1Kb長的模板而言):
PCR前變性 |
94℃ 3分鐘 |
易錯PCR(循環(huán)30次) |
94℃ 1分鐘 |
45℃ 1分鐘 |
72℃ 1分鐘 |
注:易錯PCR一般不需要熱啟動,也不需要在PCR結(jié)束后做延伸處理。長度每增
加1Kb,時間延長1分鐘。易錯PCR循環(huán)次數(shù)決定每個核苷酸位置的突變幾率,進而決定每個PCR產(chǎn)物可能的突變位點數(shù),所以所需循環(huán)數(shù)由客戶根據(jù)需要改動。
5.電泳檢測是否得到預(yù)計長度的PCR產(chǎn)物。
6. 克隆片段進行功能篩選、或者克隆后進行測序分析突變率、或者用此輪PCR的產(chǎn)物為模板,進行下一輪的易錯PCR。
疑難解答:
Q:現(xiàn)象:沒有PCR產(chǎn)物。
A:可能原因:一是引物沒有優(yōu)化,可以重新設(shè)計引物;二是模板DNA太少,可以增加用量;三是模板不純,最好先膠回收;四是溶解DNA的溶液中有EDTA,降低了PCR反應(yīng)體系的Mg離子濃度,可以適當(dāng)補加Mg離子。
Q:現(xiàn)象:太多的PCR條帶或PCR條帶模糊一片。
A:可能原因:一是PCR循環(huán)數(shù)太多;二是復(fù)性溫度太低;三是延伸時間太長;四是引物沒有優(yōu)化,可以重新設(shè)計引物;五是PCR條件沒優(yōu)化,可以使用touch-down PCR;六是模板有其他DNA污染;七是DNA模板質(zhì)量不高或者濃度太高。
Q:如果需要更高的突變率,如何辦?
A:可以使用連續(xù)多次易錯PCR來提高突變率。但最好先用膠純化回收PCR片段,再用于下一輪易錯PCR。此外不能用少于千分之一的第一次PCR產(chǎn)物作為第二輪易錯PCR的模板,否則多樣性將受到影響。第三輪易錯PCR最好使用所有第二輪的PCR產(chǎn)物作為模板,但需要在10mL體系中完成(可以分成很多100μL體系進行)。
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關(guān)注
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