全長Bst DNA聚合酶

特別提示：包括全長Bst DNA聚合酶在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：全長Bst DNA聚合酶
英文名稱：Bst DNA Polymerase, Full Length
產(chǎn)品貨號：JN3013
產(chǎn)品規(guī)格：250U|250U×5

Bst DNA聚合酶來源于Bacillus stearothermophilus，具有5"→3" DNA聚合酶活性和雙鏈特異的5"→3"核酸外切酶活性，但缺失3"→5"核酸外切酶活性。本制品利用基因重組技術(shù)，將全長Bst DNA聚合酶在大腸桿菌中進行表達(dá)后經(jīng)多次純化分離而得。該酶應(yīng)用于DNA測序，模板可低至納克級別。

產(chǎn)品用途：
 

• 富含GC序列的DNA序列測定；
• 微量（納克量）DNA模板的快速測序等。

注意事項：
 

• Bst DNA聚合酶不具有3′→5′外切酶活性。
• 長期貯存需加入100μg/ml BSA或0.1%Triton X-100。
• 建議反應(yīng)溫度不要超過70℃。
• 不能用于熱循環(huán)測序或PCR。

產(chǎn)品組成：
 

組分	250U
全長Bst DNA聚合酶	50μL
10×反應(yīng)緩沖液	200μL

質(zhì)量保證：
經(jīng)多次柱純化，SDS-PAGE膠檢測僅可見清晰單一的目的條帶，qPCR方法檢測無大腸桿菌DN A殘留，無核酸內(nèi)、外切酶污染。

活性定義：
在65℃條件下，30分鐘內(nèi)使1nmol的dNTPs摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定義為1個活性單位。

10×反應(yīng)緩沖液：
200mM Tris-HCl，100mM(NH₄)₂SO₄，500mM KCl，20mM MgSO₄，1% Tween 20，pH8.8儲存于25℃。

貯存液：
50mM KCl，10mM Tris-HCl (pH7.5)，1mM DTT,0.1mM EDTA，0.1% Triton X-100和50% Glycerol。

反應(yīng)條件：
1×反應(yīng)緩沖液，65℃溫浴。

熱失活：
80℃，20分鐘

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名稱：DNA末端平滑試劑盒
貨號：YT404
規(guī)格：20次
本試劑盒可以進行20個常規(guī)的末端平滑化反應(yīng)。本品是利用T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase)的5"→3"DNA聚合酶活性和3"→5"的DNA外切酶活性，用于將酶切或PCR等反應(yīng)后產(chǎn)生的粘末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠侥┒说脑噭┖�。�?jīng)過本試劑盒處理產(chǎn)生的平末端DNA片段可以用于常規(guī)的平端連接反應(yīng)。

粘末端有兩種，一種為5"端突出末端，另外一種為3"端突出末端。本試劑盒可以將5"端突出末端補平，也可以將3"端突出末端削平(也稱打平)。

當(dāng)末端為5"端突出末端時，T4 DNA Polymerase可以利用其5"→3"DNA聚合酶活性將末端補平；當(dāng)末端為3"端突出末端時，T4 DNA Polymerase可以利用其3"→5"DNA外切酶活性將末端削平。

產(chǎn)品組份：
T4 DNA Polymerase(1U/μl)————20μl
Reaction Buffer(5X)———————100μl
dNTP Mixture(2.5mM each)—————50μl

Reaction Buffer(5X)：335mM Tris-HCl(pH8.8 at 25℃)，33mM MgCl2，5mM DTT， 84mM(NH4)2SO4。

儲存條件：-20℃

名稱：T4 DNA連接酶
貨號：WE0239
規(guī)格：100U|500U
  T4 DNA Ligase 是從表達(dá)T4 DNA Ligase 基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后分離純化而來的，催化相鄰DNA鏈的5’磷酸基團和3’羥基基團以磷酸二酯鍵結(jié)合反應(yīng)。該酶可催化平末端或粘性末端DNA之間的連接，還可修復(fù)雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切口。本品可應(yīng)用于DNA插入片段和載體DNA的粘性末端和平末端的連接，以及線性DNA的自身環(huán)化。

產(chǎn)品組成：
 

組份	100U	500U
T4 DNA Ligase，5 U/μl	20μl	100μl
10×Ligation Buffer	150μl	750μl
50%PEG Solution	150μl	750μl

實驗前準(zhǔn)備及重要注意事項
1、T4 DNA Ligase的最終用量不要超過推薦的用量，否則影響連接效率。
2、PEG可以極大提高平末端的連接效率，我們推薦加入終濃度為5% PEG Solution以提高平末端的連接效率。
3、為了提高轉(zhuǎn)化效率，建議所加入連接產(chǎn)物的量不要超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。
4、由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易掛壁，建議使用之前短暫離心將液體收集到管底，取樣時槍頭盡量不要深入液面太深以免粘在槍頭上造成損失。

使用方法：

一、粘性末端的連接：

1、按以下體系配制反應(yīng)液：
 

組份	20μl體系	終濃度
線性載體DNA	Xμl	20-100ng
插入DNA片段	Yμl	插入片段：載體1:1-5:1
10×Ligation Buffer	2μl
T4 DNA Ligase，5 U/μl	0.2μl	1 U
ddH2O	補充至20μl

2、渦旋震蕩，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3、反應(yīng)條件：22℃孵育10分鐘。
4、瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底，65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase。
5、可取5μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞。
注意：如需電擊轉(zhuǎn)化，推薦用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后進行電擊轉(zhuǎn)化。

二、平末端的連接：

1．反應(yīng)體系：
 

組分	20μl體系	終濃度
線性載體DNA	Xμl	20-100ng
插入DNA片段	Yμl	插入片段：載體1:1-5:1
10×Ligation Buffer	2μl
T4 DNA Ligase，5 U/μl	1μl	5 U
50%PEG Solution	2μl	5%
ddH2O	補充至20μl	20μl

2、渦旋震蕩，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3、反應(yīng)條件：22℃孵育1小時。
4、瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底，65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase。
5、可取5μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞。
注意：如需電擊轉(zhuǎn)化，推薦用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后進行電擊轉(zhuǎn)化。

三、線性DNA的自身環(huán)化：

1、反應(yīng)體系：
 

組分	50μl體系	終濃度
線性載體DNA	Xμl	5-50ng
10×Ligation Buffer	5μl
T4 DNA Ligase，5 U/μl	1μl	5 U
ddH2O	補充至50μl	50μl

2、渦旋震蕩，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3、反應(yīng)條件：粘性末端22℃孵育10分鐘；平末端22℃孵育1小時。
4、瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底，65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase。
5、可取5μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞或取1-2μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50μl感受態(tài)細(xì)胞。
注意：如需電擊轉(zhuǎn)化，推薦用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后進行電擊轉(zhuǎn)化。

儲存條件：-20℃。

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