植物脂筏分離試劑盒

儲(chǔ)存溫度：4℃
試劑盒組分： 1. 緩沖液 A 10ml 2. 緩沖液 B 10ml 3. 緩沖液 C 1.2ml 4. 緩沖液 D 10ml 5. 塑料研磨棒 2 根 6. 蛋白提取粉 2g 7. 離心管柱/收集管 20 套 運(yùn)輸儲(chǔ)存：常溫運(yùn)輸，4 度保存

重要產(chǎn)品信息：
1. 操作前請(qǐng)仔細(xì)閱讀整個(gè)操作說明。緩沖液 A，B，C 使用前放置于冰上預(yù)冷。
2. 離心機(jī)請(qǐng)調(diào)整成 RCF 模式（xg），所有離心步驟都需要在 4℃室溫下或者低溫離心機(jī)中進(jìn)行。
3. 研究蛋白磷酸化，磷酸酶白酶抑制劑應(yīng)在使用前加入緩沖液 A 中。（請(qǐng)按照蛋白酶或磷酸酶抑制劑母液比例添加，例如母液是 100x，添加時(shí)按照 1：100 添加，即 1ml 緩沖液 A 添加 10ul 抑制劑）。
4. 需準(zhǔn)備預(yù)冷的 ddH2O。
5. 請(qǐng)勿使用液氮研磨，研磨方式請(qǐng)按說明書進(jìn)行。
操作方法：
1. 將 200-250mg 新鮮植物葉片或幼苗加到離心管柱中，將葉片折疊卷起塞入到離心管柱套管中。加入 100ul緩沖液 A，用 200ul 吸頭按壓葉片 80-100 次以壓縮葉片體積（此步大概需要 1-2min）。加 50-80mg 蛋白提取粉到離心管柱中。
2. 用試劑盒中研磨棒用力向下扭轉(zhuǎn)按壓研磨 200 次（大約 2-3min）。（注意：研磨棒可重復(fù)使用，用 70%酒精擦拭或用蒸餾水沖洗干凈，用紙巾擦干。）
3. 再加 400ul 緩沖液 A 到離心柱中，用 200ul 吸頭將樣品攪拌混勻。蓋上蓋子，8000Xg 離心 10min。這一步可以去除葉綠體，細(xì)胞核和一些大碎片。離心后，棄去離心柱，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的 1.5ml 離心管中。
4. 16000Xg，離心 30min，棄去上清。小心的加入 1ml 預(yù)冷的 ddH2O 清洗沉淀，不要打散沉淀，將水立即棄 掉。
5. 加入 450ul 緩沖液 B 吹打沉淀重懸，再向管中加入 50ul 緩沖液 C，混勻后放于冰上孵育 30min。孵育完成后，大力渦旋震蕩 20s，10000Xg，離心 5min。離心后將上清轉(zhuǎn)移至新的 1.5ml 離心管中。
6. 加入 500ul 緩沖液 D，簡(jiǎn)單振蕩混勻，冰上孵育 10min。孵育完成后 10000Xg，離心 5min。離心后，脂筏
會(huì)漂浮在管子最上層。
7. 用移液器配上細(xì)的吸頭（如 SDS-PAGE 上樣吸頭）插到管底，緩慢地完全去除水相。或者也可以使用配 有 21 號(hào)針頭的 2 毫升注射器。去除水相后（非脂筏的膜蛋白保留在這個(gè)水相中，如有興趣可保留），淺綠
白色的脂筏會(huì)附著在離心管壁上。
8. 將離心管 16000Xg，離心 5min，將脂筏離心到管底部，完全去除殘液。小心的加入 200μl 預(yù)冷的 ddH2O清洗沉淀，不要打散沉淀，并將水快速棄掉。得到的沉淀即是分離的脂筏組分，脂筏沉淀可以根據(jù)下游應(yīng)用選擇適合的溶解液進(jìn)行溶解。蛋白溶解液可根據(jù)下表進(jìn)行選擇。根據(jù)樣品類型不同，最終蛋白質(zhì)產(chǎn)量在50-100 ug/樣品范圍內(nèi)。
技術(shù)要點(diǎn)：
1. 用于 2D 凝膠等應(yīng)用分析時(shí)，分離的脂質(zhì)筏可能需要透析以降低鹽濃度。
2. 第 7 步上清液中的非脂筏蛋白可以用蛋白質(zhì)沉淀試劑盒沉淀。
3. 分離的脂筏主要來自質(zhì)膜和其他內(nèi)膜系統(tǒng)。
4. 可以使用傳統(tǒng)的有機(jī)萃取方法從分離的脂筏中進(jìn)一步提取脂質(zhì)。