新型雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀給蛋白質(zhì)組學(xué)帶來(lái)革命性變化

Tonya Pekar Second, Justin Blethrow, Jae C. Schwartz, Vlad Zabrouskov, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA

關(guān)鍵詞：
LTQ Velos 線性離子阱，蛋白質(zhì)學(xué)，蛋白鑒定，肽測(cè)序、靈敏度、蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)者

引言：
對(duì)于一個(gè)蛋白質(zhì)組全面的了解是研究動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的鑒定是需要有效、穩(wěn)定可靠的方法。串聯(lián)質(zhì)譜尤其是線性離子阱和基于阱的雜交質(zhì)譜儀日益成為肽段和蛋白質(zhì)鑒定的首選。選擇此類儀器的主要原因在于該類儀器具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、易用性以及良好的一級(jí)和二級(jí)譜圖質(zhì)量。

在一個(gè)蛋白質(zhì)組體系里，經(jīng)常會(huì)存在一些低豐度不易被質(zhì)譜儀鑒定到的蛋白，其中某些蛋白還會(huì)存在一些動(dòng)態(tài)修飾，就更難被儀器檢測(cè)到。因此，需要發(fā)展更先進(jìn)靈敏度更高的一切來(lái)應(yīng)對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)組蛋白鑒定的需求。
本篇應(yīng)用論文主要介紹了用新型雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀分析復(fù)雜、Caenorbabditis elgans(C.elegans)的肽段混合物。比較了新型雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀與線性離子阱和廣泛應(yīng)用的四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的性能。

儀器創(chuàng)新
在本篇文章主要測(cè)試Thermo Scientific 的LTQ Velos離子阱質(zhì)譜儀。它包括了一個(gè)新型雙壓線性離子阱和高壓環(huán)形離子導(dǎo)入裝置（S-Lens），如圖1所示。

S-lens的射頻顯著提高了離子注入到質(zhì)譜儀中，這降低了在線性離子阱中離子累積所需要的時(shí)間。

雙壓阱的第一個(gè)池的壓力比以前線性離子阱的壓力要高，大約在5×10-3Torr，這能夠顯著提高目標(biāo)離子的捕獲效率、分離效率和碎裂效率。提高的分離效率顯著降低了前體離子所需要的時(shí)間，所需時(shí)間是從前的四分之一。LTQ Velos離子阱對(duì)于在有高豐度干擾離子背景下低豐度前體離子具有較好的選擇性，提高了二級(jí)質(zhì)譜分析的動(dòng)態(tài)范圍。高壓也縮短了碰撞誘導(dǎo)解離所需的時(shí)間的67%，同時(shí)保持了同樣的碎裂效率。第二個(gè)池保持較低的壓力，大約在4×10-4Torr，可以以較高的分辨率進(jìn)行快速質(zhì)量分析。

高捕獲效率
高裂解效率
高分離效率
5 × 10-3 氦氣
高分辨率、掃描速度
3.5 × 10-4 氦氣

圖一 LTQ Velos 質(zhì)譜儀 ，高壓環(huán)形離子導(dǎo)入裝置（ S-Lens ）和 新型雙壓線性離子阱（不同壓力控制）

與新型雙壓線性離子阱協(xié)力合作，在典型的數(shù)據(jù)依賴模式的串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，在阱里一種新型控制離子累積的方法能顯著提高實(shí)際的掃描速率。這個(gè)功能叫做“預(yù)測(cè) AGC ”，去除了每一次串聯(lián)質(zhì)譜掃描所做的預(yù)掃，基于離子流出和前一次一級(jí)質(zhì)譜全掃描的母離子的相對(duì)強(qiáng)度，預(yù)測(cè)了離子累積所需要的時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)

樣品制備

C.elgans 勻漿液的可溶性部分用 pH7.8 的碳酸氫銨稀釋，加入 0.1% 的 RapiGest 表面活性劑，解釋用二硫蘇糖醇在 100 ℃ 還原二硫鍵，并用碘乙酰胺對(duì)半胱氨酸烷基化。樣品解釋用對(duì) K/R 特異性酶酶切 4 個(gè)小時(shí)。酶解物質(zhì)酸化后存放至 -80 ℃ 。在進(jìn)入反相高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜前用 0.1% 的甲酸稀釋。

液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜分析

為了比較和評(píng)估性能，在 Thermo Scientific 的 LTQ XL 線性離子阱質(zhì)譜儀和安捷倫 6520 四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀一級(jí) LTQ Velos 雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀對(duì) C.elegans 的蛋白酶解物進(jìn)行了分析，肽段混合物是在反相色譜進(jìn)行分離的。詳細(xì)的色譜條件請(qǐng)參照表 1 。同時(shí)對(duì)減少進(jìn)樣量進(jìn)行了考察。

在所有實(shí)驗(yàn)中，均采用數(shù)據(jù)依賴的串聯(lián)質(zhì)譜采集方法。在每一臺(tái)儀器上至少運(yùn)行 3 次樣品。

對(duì)于線性離子阱的數(shù)據(jù)依賴模式檢測(cè)方法，該方法主要分析十個(gè)最強(qiáng)的離子，根據(jù)色譜峰的峰寬，優(yōu)化排除條件，色譜峰的峰寬主要是根據(jù)反相梯度長(zhǎng)度變化。由于在 LTQ Velos 質(zhì)譜儀離子源有較好的離子傳輸，因此一級(jí)質(zhì)譜全掃描需要較低的最大注射時(shí)間。在進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描的時(shí)候，可用同樣的最大注射時(shí)間，這樣可以捕獲更多的例子，進(jìn)而鑒定得到低豐度的肽段（前體離子豐度較低， AGC 的注射時(shí)間達(dá)到最大）。在 LTQ Velos 前體離子的選擇上采用數(shù)據(jù)依賴的模式，對(duì)一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)設(shè)置更高的閾值。離子轉(zhuǎn)移管的溫度為 250 ℃ ，比 LTQ XL 更高，目的是補(bǔ)償短的毛細(xì)管長(zhǎng)度。碰撞誘導(dǎo)解離的時(shí)間從 30ms 降至 10ms ，充分利用更高的壓力池，提高碎裂效率。 LTQ Velos 雙壓離子阱對(duì)于正常掃描模式同時(shí)提供了碎裂效率和掃描速率，而且阻止了單電荷的前體離子的傳輸。在數(shù)據(jù)采集模式充分利用了這個(gè)特點(diǎn)，詳細(xì)的采集參數(shù)如表 2 所示。

6520 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ Q-TOF ）的采集參數(shù)如表 3 所示。采用了 3Hz 和 6Hz 的掃描速率，以最大化實(shí)現(xiàn)對(duì)肽段進(jìn)行鑒定，實(shí)際有效的掃描速率為 2.5Hz 或 5.1Hz 。參數(shù)設(shè)置參考了安捷倫的技術(shù)支持，同時(shí)也與推薦文獻(xiàn)報(bào)道相類似。

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

通過(guò)用 Thermo Scientific 蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn) 1.0 （ Proteome Discovery) 軟件和英國(guó)倫敦 Matrix Sciences 公司的 Mascot2.1 搜索引擎對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，比較離子阱和四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀所采集的數(shù)據(jù)。用于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的條件如表 4 所示。在 Mascot 中選中反相庫(kù)檢索選項(xiàng)，對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，保證 1% 或更低的的假陽(yáng)性率。用安捷倫的軟件 Masshunter 將 6520 的四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀所采集的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為 mzdata 格式，然后提交到蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)（ Proteome Discovery) 軟件。 Proteome Discovery 軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算期望得分（或肽得分，如果選中的話）來(lái)過(guò)濾數(shù)據(jù)，達(dá)到滿足特定的假陽(yáng)性率，然后將該過(guò)濾方法應(yīng)用到數(shù)據(jù)集中。

因此，選擇高置信度的肽段過(guò)濾條件來(lái)使最終檢測(cè)到的蛋白滿足 1% 或更低的的假陽(yáng)性率。將數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的特異性肽段的數(shù)量和蛋白數(shù)進(jìn)行比較。

儀器	Thermo Scientific 離子阱	Q-TOF （四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜）
HPLC （高壓液相色譜）	Thermo Scientific Surveyor MS Pump	Agilent 1200 Series HPLC
離子源	Nanospray I	Agilent HPLC-Chip/MS System
分析柱	Michrom Magic C18AQ packed tip 150 mm x 75 μm I.D. x 15 μm tip 5 μm particle, 250 ?pore size	Agilent Protein ID Chip #3 (up to 4 μg capacity) SB-ZORBAX C18 150 mm x 75 μm I.D. 5 μm particle, 300 ?pore size
流速	~ 300 nL/min at 50% organic	300 nL/min
梯度	2-25% acetonitrile in 0.1% formic acid(either 60 minutes or 180 minutes)	5-30% acetonitrile in 0.1% formic acid(either 60 minutes or 180 minutes)

表 1 肽段一維反相色譜分離條件

質(zhì)譜儀	LTQ Velos	(LTQ XL)
毛細(xì)管溫度	250 °C	( 200 °C )
離子源參數(shù)	S-Lens 40%	(Tube Lens 100 V)
AGC Targets Full	MS: 3e4
	MSn: 1e4
最大注射時(shí)間	一級(jí)質(zhì)譜 : 10 msec (Full MS: 50 msec)
	多級(jí)質(zhì)譜 : 100 msec
一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍	400 -1200 m /z
隔離寬度	2 m /z
碰撞類型	CID 碰撞誘導(dǎo)解離
歸一化能力	30%
碰撞時(shí)間	10 msec		(30 msec)
缺省帶電量	3
DDA 選擇閾值	1000		(10,000)
方法	Top 10 most intense DDA
Number of Microscans	1
掃描速率	正常
排除 單電荷	是		否
動(dòng)態(tài)排除功能	Exclusion duration: 排除周期 15 sec (60 min), 30 sec (180 min) List size: 500
	Repeat count: 1 Mass width: low-1.0, high 1.5

表 2 ： LTQ Velos and LTQ XL 質(zhì)譜 儀采集參數(shù)

質(zhì)譜儀	Agilent 6520 Q-TOF
ESI 條件	HPLC-Chip NSI Interface
芯片氣體溫度	300 °C
干燥器溫度	4 L /min
一級(jí)質(zhì)譜采集頻率	3, 6, or 8 Hz
二級(jí)質(zhì)譜采集頻率	3 or 6 Hz
一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍	200 -2000 m /z
碰撞能力	Slope: 3 V
	Offset: 2 V
方法	Top 6 DDA
	Precursors sorted by abundance 按照豐度排序前體離子
帶電量選擇	拒絕單電荷
動(dòng)態(tài)排除	Duration: 30 秒 (60 min),
	60 秒 (180 min)
	Repeat count: 1

表 3 四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采集參數(shù)

軟件平臺(tái)	Proteome Discoverer
搜索引擎	MASCOT v 2.1
數(shù)據(jù)庫(kù)	NCBI, April 2008
最大漏切數(shù)目	1
前體離子容忍度	離子阱數(shù)據(jù) : 1.4 Da
	四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù) : 40 ppm
碎片容忍度	離子阱數(shù)據(jù)
	四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù) : 100 mmu
蛋白質(zhì)量	不限制
反庫(kù)搜索	使用
儀器類型	離子阱數(shù)據(jù) : ESI-TRAP
	四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù) : ESI-Q-TOF
修飾	固定修飾 : 半胱氨酸烷基化
得分	MUDPIT scoring
	蛋白 cut-off: 20
	肽 cut-off: 10
DTA 產(chǎn)生條件	總離子強(qiáng)度閾值 : 100
	最小離子數(shù) : 10
	信噪比閾值： 2 前體離子范圍 700 -5000 m /z ( 離子阱 ), 700 -7000 m /z ( 四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜 )

Table 4: 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)庫(kù)搜索條件

結(jié)果與討論

LTQ Velos 比 LTQ XL 和 Q-TOF 鑒定到了更多的特異性肽段

圖 2 ： 1ug C.elegans 酶解樣品在 60 分鐘內(nèi)運(yùn)行色基峰色譜圖比較（上圖為 LTQ Velos 雙壓離子阱質(zhì)譜儀，下圖為四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀）

與線性離子阱 LTQ XL 和四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 Q-TOF 相比， LTQ Velos 雙壓離子阱質(zhì)譜儀從 C.elegans 的胰酶酶解物中鑒定得到了更多的特異性肽段。有更多的蛋白被鑒定到。圖 2 顯示的是在 60 分鐘的梯度內(nèi)用反相色譜 -LTQ Velos 質(zhì)譜儀得到的基峰色譜圖，以及用 1200 高效液相色譜 - 芯片分離 - 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜一得到基峰質(zhì)譜圖。在 60 分鐘的分離過(guò)程， LTQ Velos 質(zhì)譜儀比 LTQ XL 質(zhì)譜儀多鑒定了 67% 的特異性肽段，比 Q-TOF 多鑒定了 165.7% 的特異性肽段，上述結(jié)果都是在 3Hz 情況下得到的。在相同的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， LTQ Velos 離子阱鑒定到蛋白的數(shù)目比四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 Q-TOF 多了 240% 。在實(shí)驗(yàn)中，鑒定到的蛋白和特異性肽段的數(shù)目都是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)取的平均值，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 10% 。每一次運(yùn)行樣品，平均百分比都增加了，但并不是所有重復(fù)數(shù)據(jù)都增加了。

圖 3 樣品： 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物 在反相色譜分離。 LTQ Velos 雙壓離子阱比 LTQ XL 離子阱和四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀能鑒定到更多的特異性肽段和蛋白。圖中所示為兩個(gè)梯度的結(jié)果，也標(biāo)出了每一個(gè)儀器的實(shí)際采樣速率。

如圖 4 所示，在不同儀器之間，有很多蛋白會(huì)重復(fù)出現(xiàn)，即被不同儀器同時(shí)鑒定到。在 60 分鐘的分離過(guò)程中， LTQ Velos 雙壓離子阱鑒定到了 LTQ XL 得到到蛋白數(shù)目的 88% ， LTQ Velos 雙壓離子阱鑒定到了 Q-TOF 得到蛋白數(shù)目的 90% ，此外，還有 570 個(gè)蛋白沒(méi)有被其他儀器鑒定到，大約占 53% 。因此， LTQ XL 和 Q-TOF 鑒定到的蛋白大部分都被 LTQ Velos 鑒定到，而且還有許多上述兩儀器沒(méi)有鑒定到的。在 LTQ Velos 反復(fù)對(duì)同一樣品進(jìn)行分析的時(shí)候，能重復(fù)鑒定到的蛋白超過(guò) 70% ，而且有 85% 的蛋白能過(guò)被鑒定到兩次或三次，說(shuō)明 LTQ Velos 的重現(xiàn)性較好 .

圖 4 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物在 60 分鐘內(nèi)用反相色譜分離，不同儀器鑒定到的蛋白。（ 1% 假陽(yáng)性率）

/	LTQ XL	LTQ Velos	增加百分比
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白	21	49	133%
激酶	11	24	118%
磷酸酶	15	31	107%

表 5 用 LTQ Velos 離子阱比 LTQ XL 離子阱能鑒定得到更多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白

LTQ Velos 有更好的靈敏度

在復(fù)雜混合物中，由于低豐度的前體離子存在于寬動(dòng)態(tài)范圍的背景基質(zhì)中，需要很好的靈敏度（很強(qiáng)的信號(hào)），而且需要好的選擇性，目標(biāo)離子的選擇效率以及能應(yīng)對(duì)復(fù)雜體系的采集速度。 LTQ Velos 質(zhì)譜儀對(duì)于在高度復(fù)雜背景下關(guān)鍵低豐度蛋白的檢測(cè)有更好的靈敏度。用 Proteome Discovery 軟件對(duì)檢索得到的蛋白結(jié)果進(jìn)行注釋，如功能，亞細(xì)胞位置等。這些信息來(lái)源于公共的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（如 Swissprot 和 NCBI ） , 在 180 分鐘的梯度運(yùn)行一次目標(biāo)樣品，將檢索到的蛋白進(jìn)行分類， LTQ Velos 雙壓離子阱比 LTQXL 多檢出了 133% 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，而且多檢測(cè)了兩倍數(shù)目的激酶和磷酸酶。

此外，只有 LTQ Velos 雙壓離子阱鑒定到了低豐度的的轉(zhuǎn)錄因子 ntl-3 ，它主要參與生長(zhǎng)調(diào)控，還鑒定到了 F4369 主要參與細(xì)胞定位。

為了進(jìn)一步證明 LTQ Velos 雙壓離子阱對(duì)于分析低豐度化合物的能力，比如在組織或細(xì)胞里天然豐度較低的蛋白或肽段，樣品被稀釋了 50 倍，在兩臺(tái)線性離子阱上進(jìn)行分析，由LTQ Velos 雙壓離子阱 鑒定得到的特異性肽段比 LTQ XL 多 152% ，主要是由于 LTQ Velos 雙壓離子阱有高靈敏的二級(jí)質(zhì)譜鑒定能力，有更好的離子傳輸效率，對(duì)于弱的前體離子信號(hào)， LTQ Velos 雙壓離子阱能在有限的最大注射時(shí)間內(nèi)傳輸更多的離子到阱內(nèi)，因此提高了二級(jí)質(zhì)譜的靈敏度， LTQ Velos 雙壓離子阱由較快的掃描速率，也增加了低豐度的前體離子被鑒定到的幾率。

圖 5 20ng 進(jìn)樣量 60 分鐘的色譜梯度 LTQ Velos 雙壓離子阱比 LTQ XL 離子阱能增加對(duì)低豐度蛋白鑒定的量。

LTQ Velos 雙壓離子阱提高實(shí)驗(yàn)通量

快速的掃描速率，不但提高了儀器工作循環(huán)的次數(shù)，同時(shí)也縮短了色譜分離時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)的通量，對(duì)于同一個(gè)復(fù)雜混合物， LTQ Velos 雙壓離子阱在 60 分鐘內(nèi)鑒定到的特異性肽段比 LTQ XL 離子阱在 180 分鐘內(nèi)鑒定到的還要多，因此，對(duì)于簡(jiǎn)單而又有寬動(dòng)態(tài)范圍（如膠條帶）的混合物分析，可以顯著提高其通量。對(duì)于某些需要多次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，如方法開發(fā)，或涉及生物樣品重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，用此儀器就非常方便快捷。同樣對(duì)于定量試驗(yàn)，用 LTQ Velos 雙壓離子阱也具有很大的優(yōu)勢(shì)，因此它有較快的掃描速度，更多的掃描次數(shù)，可以對(duì)較窄的色譜峰進(jìn)行多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的采集，因此適用于超高壓液相色譜分離和短運(yùn)行時(shí)間的分析實(shí)驗(yàn)。

為什么四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ Q-TOF ）儀器鑒定的蛋白較少

對(duì)來(lái)源于 Q-TOF 儀器的數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)分析，一級(jí)質(zhì)譜全掃描的譜圖質(zhì)量與 LTQ Velos 幾乎相當(dāng)，而且信噪比和譜圖特征也很類似，而且 Q-TOF 有更好的質(zhì)量準(zhǔn)確度（在 1% 假陽(yáng)性率鑒定到的肽的 RMS 有 9PPM ），結(jié)果顯示，在一定的分析時(shí)間內(nèi)如 60 分鐘，對(duì)于肽段鑒定的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，全掃描的靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍、或質(zhì)量準(zhǔn)確度不是決定因素，掃描速率可能是一個(gè)決定性因素，隨著分離時(shí)間延長(zhǎng)，掃描速率影響不是特別大，但肽和蛋白鑒定數(shù)目也提高了，如圖 3 所示。對(duì)于掃描速率的詳細(xì)討論，請(qǐng)參考下面的 Q-TOF 掃描速度對(duì)靈敏度的影響。

由 LTQ Velos 雙壓離子阱鑒定到的前 20 個(gè)蛋白的 Mascot 平均得分為 1113.4 ，在 3Hz 掃描速度工作下的 Q-TOF 前 20 個(gè)蛋白平均得分為 506.7 ，前者是后者的一倍還多。 Q-TOF 的二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量較差，導(dǎo)致了較少的肽段被鑒定到。 Q-TOF 一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜的高質(zhì)量準(zhǔn)確度并沒(méi)有彌補(bǔ)低質(zhì)量的二級(jí)質(zhì)譜譜圖。如，與線性離子阱獲得的質(zhì)譜圖相比，有較少的序列離子，當(dāng)檢索參數(shù)設(shè)置為 MS1.4Da MS/MS 0.8 ，離子阱的二級(jí)質(zhì)譜掃描譜圖質(zhì)量已經(jīng)夠高，結(jié)果顯示，線性離子阱（ LTQ ）系統(tǒng)比四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間（ Q-TOF ）在蛋白鑒定更具優(yōu)勢(shì)。

圖 6 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物在反相色譜分離的基峰圖，四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜和 LTQ Velos 線性離子阱全掃描動(dòng)態(tài)范圍的比較

Q-TOF 掃描速率對(duì)靈敏度的影響

如圖 7 所示，將 Q-TOF 掃描速率從 3Hz 升至 6Hz ，導(dǎo)致鑒定到肽段數(shù)目減少，這主要是因?yàn)殡S著 Q-TOF 質(zhì)譜儀的掃描速率提高，一級(jí)質(zhì)譜圖特別是二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量下降。增加的掃描速度減少了離子的傳輸時(shí)間，由于較少的離子被檢測(cè)到和平均化，因此降低了譜圖的信噪比。如圖 8 所示，將 Q-TOF 掃描速率從 3Hz 升至 8Hz ，損失了 66% 的 Q-TOF 信號(hào)，在二級(jí)質(zhì)譜圖可檢測(cè)到的特征離子數(shù)目減少了。

增加的 MS/MS 采集的掃描速率，降低了二級(jí)質(zhì)譜圖的質(zhì)量和信噪比，而且 Mascot 鑒定到的肽段的得分也受影響，如圖 9 所示，二級(jí)質(zhì)譜圖掃描幾乎來(lái)源于色譜峰的頂點(diǎn)。在高質(zhì)量 Q-TOF3Hz 譜圖下， Mascot 得分為 49 分，而且 LTQ Velos 雙壓離子阱對(duì)于同一樣品，進(jìn)樣量只有 Q-TOF80% 的時(shí)候， Mascot 的得分為 103 分，前者比后者低了 53% ，當(dāng) Q-TOF 在 6Hz 運(yùn)行時(shí)，對(duì)于 1 μ g 的樣品在 180 分鐘的運(yùn)行時(shí)間內(nèi)，鑒定到的肽段數(shù)目下降了 40% ，這就是為什么盡管儀器的掃描速率可以達(dá)到 10Hz ，在做肽段鑒定實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，廠家不建議其采樣速率超過(guò) 3Hz 的原因。

擁有專利技術(shù)的 pAGC ，在阱內(nèi)可實(shí)現(xiàn)離子累積， LTQ Velos 雙壓離子阱不管前體離子的峰強(qiáng)度，對(duì)于二級(jí)質(zhì)譜的離子數(shù)目進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，在 180 分鐘的梯度內(nèi)，在實(shí)際掃描速率為 6.3Hz 運(yùn)行下的 LTQ Velos 雙壓離子阱比 6Hz 運(yùn)行下的四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ Q-TOF ）多檢測(cè)到了 282% 個(gè)特異性肽段。

圖 7 1ug C.elegans 蛋白胰酶酶解物在 180 分鐘內(nèi)用四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ 3Hz 和 6Hz ）和 LTQVelos 線性離子阱鑒定到特異性肽段數(shù)目的比較

圖 8 在 Q-TOF 儀器上比較不同質(zhì)譜掃描速率下信號(hào)的強(qiáng)度

圖 9 四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜在兩個(gè)不同二級(jí)質(zhì)譜掃描速率下，對(duì)同一個(gè)二價(jià)前體離子 LVGDLDDAQVDVER 二級(jí)質(zhì)譜圖的比較。而 LTQ Velos 離子阱對(duì)同一前體離子檢測(cè)只用了 80% 的樣品量。

結(jié)論：在一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)組樣品中，高靈敏的檢測(cè)和鑒定化合物對(duì)于了解和認(rèn)知?jiǎng)討B(tài)蛋白質(zhì)學(xué)具有極其重要的意義。隨著技術(shù)的革新， LTQ Velos 雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，，大幅度提高了肽段和蛋白鑒定的個(gè)數(shù)，與當(dāng)前主流的技術(shù)相比， LTQ Velos 雙壓線性離子阱質(zhì)譜儀由于其超高的采集速度和高的靈敏度，增加了低豐度的前體離子的鑒定數(shù)目。

•  在一個(gè)復(fù)雜混合樣品中， LTQ Velos 離子阱比四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜能多鑒定 240% 個(gè)蛋白質(zhì)和 130% 個(gè)特異性肽段，而且，通過(guò)四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定到的蛋白，有 90% 以上都能在 LTQ Velos 看到。

•  LTQ Velos 雙壓線性離子阱對(duì)于低含量的物質(zhì)有較高的靈敏度。上樣量在 20ng 的時(shí)候，與 LTQ XL 離子阱相比， LTQ Velos 雙壓線性離子阱對(duì)于特異性肽段的鑒定增加了 150% 。

•  隨著鑒定蛋白數(shù)目的增多， LTQ Velos 雙壓線性離子阱給出了更多的低豐度的蛋白，在這里面，對(duì)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的量提高了 133% 。

•  LTQ Velos 雙壓線性離子阱提高了實(shí)驗(yàn)的通量，對(duì)于復(fù)雜樣品的分離，比 LTQ XL 離子阱在三分之一的分離時(shí)間里，鑒定了更多的蛋白和肽段。

•  相比四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，在線性離子阱中能得到更高質(zhì)量的二級(jí)質(zhì)譜圖，這樣在 Mascot 檢索中能得到更高的分?jǐn)?shù)。通過(guò)四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀得到高質(zhì)量準(zhǔn)確度的圖對(duì)于肽段的鑒定是有益的但還不夠。

•  提高四級(jí)桿 - 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的掃描速度會(huì)降低一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖的信號(hào)和譜圖質(zhì)量，同時(shí)導(dǎo)致減少鑒定到肽段的數(shù)目。

參考文獻(xiàn)

•  Horn, D.M., Miller, C.A. , Miller, B.D. The Effect of MS/MS Fragment Mass Accuracy on Peptide Identification in Shotgun Proteomics. Application Note 5989-7820 EN. www.agilent/chem/proteomics

感謝

感謝華盛頓大學(xué)基因科學(xué)系 Gennifer Merrihew 提供 C.elegans 樣品。
賽默飛世爾科技公司 版權(quán)所有
Aglient 和 Mass hunter 是安捷倫科技公司的的注冊(cè)商標(biāo)
Mascot 是 Matrix Science 有限公司的注冊(cè)商標(biāo)
所有其他的商標(biāo)均為 賽默飛世爾科技公司和子公司的商標(biāo)。
價(jià)格和技術(shù)指標(biāo)可能會(huì)有改變，請(qǐng)咨詢當(dāng)?shù)氐匿N售代表獲得詳細(xì)的資訊。
或者訪問(wèn) Thermo Scientific 液質(zhì)聯(lián)用的應(yīng)用 www.thermo.com/appnotes
來(lái)源：Thermofisher Scientific