遺傳病家系的高通量測(cè)序：您需要了解的一些事
摘要
高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)與普及，為遺傳病的研究帶來(lái)了前所未有的機(jī)會(huì)。它提高了遺傳病致病基因克隆和鑒定的效率，使人類對(duì)自身基因功能的認(rèn)識(shí)大大加速。本文對(duì)遺傳病家系的高通量測(cè)序分析提出一些注意事項(xiàng)，希望有助于相關(guān)的研究。
前言
我國(guó)是一個(gè)多民族的人口大國(guó)，也是遺傳病家系資源比較豐富的國(guó)家之一。遺傳病家系是生命科學(xué)基礎(chǔ)理論探索和實(shí)際應(yīng)用研究的寶貴材料，是解讀人類基因功能的重要證據(jù)。依賴于對(duì)遺傳病家系的連鎖分析，對(duì)致病基因進(jìn)行定位克隆曾經(jīng)是研究遺傳病致病基因的重要手段。通過(guò)連鎖分析對(duì)致病基因進(jìn)行精細(xì)定位，往往不容易實(shí)現(xiàn)，這需要較大或較多的家系。因此，遺傳病致病基因的定位克隆并不容易。近十年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)與普及，為遺傳病的研究帶來(lái)了前所未有的機(jī)會(huì)。它提高了遺傳病致病基因克隆和鑒定的效率，使人類對(duì)自身基因功能的認(rèn)識(shí)大大加速。技術(shù)上的進(jìn)步，使得近幾年全世界范圍內(nèi)遺傳病研究成果迅速涌現(xiàn)，國(guó)際上相關(guān)科研論文的發(fā)表量也連年快速上升。在國(guó)內(nèi)，許多科研團(tuán)隊(duì)準(zhǔn)備或者已經(jīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)所收集的遺傳病家系進(jìn)行分析。上海伯豪生物在多年從事高通量測(cè)序技術(shù)服務(wù)的基礎(chǔ)上，對(duì)遺傳病家系的高通量測(cè)序分析提出一些注意事項(xiàng)，希望有助于相關(guān)的研究。
一．遺傳病家系信息的收集及樣本的采集
對(duì)所感興趣的遺傳病事先進(jìn)行充分的了解是非常重要的。它是真正的遺傳病嗎？遺傳病由遺傳物質(zhì)改變引起，可在家族內(nèi)聚集，但有些在家族內(nèi)群發(fā)的疾病并非遺傳病。它的發(fā)病頻率有多少？發(fā)病頻率的大小涉及到高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的過(guò)濾分析，需要注意。它是單基因遺傳病還是復(fù)雜性狀遺傳病？后者的研究難度較大。如果研究者不是相關(guān)專業(yè)的醫(yī)生，與醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床�？漆t(yī)生或遺傳咨詢醫(yī)生合作將非常有助于即將進(jìn)行的研究。合作可以使研究者在短時(shí)間內(nèi)快速了解該遺傳病，也可以使其有機(jī)會(huì)接觸更多的該種遺傳病的家系。
遺傳病家系信息的收集及樣本的采集直接影響研究項(xiàng)目的進(jìn)度。對(duì)家系信息的收集，應(yīng)盡可能全面、確鑿，盡量避免信息的漏檢和誤錄。盡可能邀請(qǐng)疾病家系中熟悉家族歷史沿革和各個(gè)成員狀況的代表參加患病家系的信息咨詢，如果條件允許，可邀請(qǐng)數(shù)位代表同時(shí)參加，以確保信息來(lái)源準(zhǔn)確。要注意家系中過(guò)繼、后續(xù)親屬的情況或近親結(jié)婚的情況。有些家系成員，盡管已經(jīng)去世，但通過(guò)他人盡可能地了解該成員是否有患病癥狀，仍然很重要，因?yàn)檫@些信息可能幫助判定疾病遺傳方式。全面準(zhǔn)確的家系信息有助于判定致病基因的傳遞類型，有助于高通量測(cè)序個(gè)體的挑選和數(shù)據(jù)分析，而測(cè)序?qū)ο蟮倪x擇和數(shù)據(jù)分析直接影響項(xiàng)目進(jìn)度。有些家系比較小，不利于疾病位點(diǎn)的連鎖分析定位，但仍然有應(yīng)用價(jià)值。高通量測(cè)序不一定需要很大的家系；而且，可以利用多個(gè)同類疾病的小家系，進(jìn)行綜合研究。
對(duì)家系成員疾病癥狀的仔細(xì)檢查、全面描述與詳細(xì)記錄也很重要。有些遺傳病與其它遺傳病有類似的或者重疊的癥狀，詳細(xì)而充分的描述可以避免對(duì)遺傳病病種的誤判，避免研究出現(xiàn)方向性錯(cuò)誤。一些遺傳病，具有遺傳和表型的異質(zhì)性，不同基因的突變，雖然導(dǎo)致同一種疾病，但疾病癥狀有差異。這些癥狀的差異提示著致病位點(diǎn)的不同。精細(xì)、豐富的癥狀信息能為基因功能研究提供更多的線索。遺傳病癥狀信息如此重要，以至于有人曾提出“人類表型組計(jì)劃（The Human Phenome Project）”。
對(duì)遺傳病家系樣品的采集，應(yīng)按知情同意和無(wú)害有利的原則，盡量一次采到足夠量的材料，避免重復(fù)采樣給家系成員帶來(lái)情感和機(jī)體上的傷害，也避免因?qū)嶒?yàn)材料不夠延誤項(xiàng)目進(jìn)程。有時(shí)，因家系成員遷移或去世等原因，重復(fù)采樣并不能實(shí)現(xiàn)，那么，一些必要的實(shí)驗(yàn)只得放棄，這必然影響項(xiàng)目進(jìn)展。采樣時(shí)，既要采集家系中患者的樣本，也要采集與患者有關(guān)的正常人的樣本。
有些遺傳病研究，可能需要從采集的樣品中抽取RNA進(jìn)行高通量測(cè)序。.那么，此時(shí)對(duì)樣品的采集和處理方式則可能與DNA測(cè)序所需的樣品有所不同。這也是需要注意的。
二. 從遺傳病家系中選擇合適的測(cè)序?qū)ο?/B>
遺傳病家系中患者和正常人的樣品采集好后，是否應(yīng)對(duì)家系中每一位患者都進(jìn)行全外顯子組測(cè)序或全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其致病變異，從而發(fā)現(xiàn)其致病基因呢？不一定。而且，這樣做花費(fèi)也比較大。有時(shí)，僅對(duì)少數(shù)患者的測(cè)序即可大幅縮小致病位點(diǎn)的搜尋范圍。如果致病基因的較詳細(xì)的定位信息已經(jīng)通過(guò)其它方法得到，有時(shí)只需測(cè)定一位病人就可發(fā)現(xiàn)致病位點(diǎn)。對(duì)于呈孟德爾方式遺傳的遺傳病，疾病在家系中的傳遞方式，影響著測(cè)序個(gè)體的選擇和測(cè)序數(shù)據(jù)的分析策略。
常染色體隱性遺傳病基因的克隆最先受益于高通量測(cè)序技術(shù)。對(duì)于一個(gè)常染色體隱性遺傳病家系，如果不存在近親結(jié)婚或生殖隔離等因素，往往患者同一致病基因的不同位點(diǎn)存在致病突變，即患者帶有復(fù)合雜合突變（compound heterozygous mutations）。由于這類患者一般不多，可以對(duì)同胞患者及其正常雙親進(jìn)行測(cè)序，分析時(shí)尋找子代復(fù)合雜合變異與雙親雜合變異共有的部分，從而發(fā)現(xiàn)致病位點(diǎn)。有時(shí)，僅對(duì)一對(duì)同胞對(duì)（sibpair）或一位患者進(jìn)行測(cè)序即可發(fā)現(xiàn)常染色體隱性遺傳病致病基因。對(duì)于近親結(jié)婚或生殖隔離等因素導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳病，患者致病基因往往存在純合突變，而患者的雙親往往是突變基因的雜合子。這時(shí)應(yīng)當(dāng)在搜尋在患者中呈純合狀態(tài)而在雙親中呈雜合狀態(tài)的變異。在這種情況下，患者雙親的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，越有利于尋找致病位點(diǎn)。有時(shí)只測(cè)一位患者也可發(fā)現(xiàn)致病基因。
疾病呈X連鎖遺傳方式傳遞的家系也適于高通量測(cè)序分析。這類家系有利于縮小致病基因搜尋范圍，因?yàn)樵S多常染色體上的變異被排除了。譬如，對(duì)于X連鎖隱性遺傳病，可以對(duì)男性患者和及其母親（致病突變攜帶者）進(jìn)行測(cè)序，尋找X染色體上共有的的變異。然而，需要注意的是，有時(shí)X連鎖與常染色體隱性遺傳方式不易區(qū)分（當(dāng)后者的家系中只有男性患者時(shí)），在進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析時(shí)需要注意。此時(shí)，前已述及的對(duì)家系中更多成員的調(diào)查就顯得重要了。
高通量測(cè)序技術(shù)用于顯性遺傳病致病基因搜尋的難度比較大，尤其對(duì)于常染色體顯性遺傳病。常染色體顯性遺傳病，致病基因的變異在雜合狀態(tài)下即可發(fā)病。常染色體雜合的變異往往很多，不容易縮小搜尋范圍。如果有相關(guān)基因的較精細(xì)的位置信息（例如小于2Mb的范圍）可以參考，則測(cè)定少數(shù)（甚至一個(gè)）患者即可確定致病位點(diǎn)。否則，則需要測(cè)定較多的患者。當(dāng)確實(shí)需要對(duì)家系內(nèi)多個(gè)患者進(jìn)行測(cè)序時(shí)，盡可能選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的（如圖1所示）。也可以對(duì)家系中的患者和正常人進(jìn)行測(cè)序，在數(shù)據(jù)分析時(shí)，在前者發(fā)現(xiàn)的雜合變異中，除去那些在后者中存在的雜合變異，余下的部分則包含致病變異。
圖1. 顯示本家系中對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的患者(III-2和III-4)的測(cè)序比對(duì)親緣關(guān)系較近的患者（II-2和II-3）測(cè)序更容易發(fā)現(xiàn)致病突變位點(diǎn)（摘自Hinchcliffe MJ. Managing incidental findings in exome sequencing for research. Methods Mol Biol. 2014;1168:207-25.）
對(duì)于某些新生突變（de novo mutations）所致遺傳病致病基因的搜尋則比較容易。對(duì)該類突變的患者及其雙親（parent-child trios）進(jìn)行測(cè)序，即可檢出在患者中出現(xiàn)而在雙親中沒有的、為數(shù)不多的變異。多測(cè)幾個(gè)家系即可鎖定致病基因（有時(shí)兩個(gè)家系即可）。如果沒有雙親樣品，也可通過(guò)對(duì)多個(gè)患者的測(cè)序找出致病基因。有時(shí)只測(cè)一個(gè)患者也有可能發(fā)現(xiàn)新生突變。
總之，充分利用家系信息和疾病基因的已有定位信息進(jìn)行高通量測(cè)序，既可減少測(cè)序花費(fèi)，也有利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。
三．高通量測(cè)序結(jié)果的確認(rèn)與驗(yàn)證
一次人類全基因組測(cè)序給出的未經(jīng)過(guò)濾的變異位點(diǎn)可達(dá)三四百萬(wàn)個(gè)；一次人類全外顯子組測(cè)序給出的原始變異位點(diǎn)可達(dá)2-5萬(wàn)個(gè)。從這些位點(diǎn)中尋找出真正導(dǎo)致所研究的疾病的變異猶如大海撈針。對(duì)于全外顯子測(cè)序來(lái)說(shuō)，通過(guò)測(cè)序質(zhì)量（如至少覆蓋的reads數(shù)等）、變異位置、變異類型、最小等位基因頻率（minor allele frequency, MAF）等指標(biāo)的過(guò)濾，可選擇的變異數(shù)可降至數(shù)千。將這些變異再與公開發(fā)布的已知變異數(shù)據(jù)庫(kù)或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)部建立的變異數(shù)據(jù)庫(kù)比較，則可將候選變異數(shù)再降低至數(shù)百。如果對(duì)一個(gè)家系中多個(gè)患者或攜帶者進(jìn)行測(cè)序，還可通過(guò)綜合分析，進(jìn)一步降低候選變異數(shù)，從而使真正的變異“水落石出”。實(shí)際上，這一過(guò)程存在例外情況和變量。有些控制指標(biāo)如測(cè)序質(zhì)量的控制、最小等位基因頻率的設(shè)定是人為可調(diào)的。這些例外情況和變量影響著最終給出的數(shù)據(jù)大小和質(zhì)量，造成測(cè)序結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性的出現(xiàn)。
高通量測(cè)序結(jié)果的某種意義上的可變性、非唯一性，決定了測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證的必要性。對(duì)于序列本身的變化當(dāng)然可以用一代測(cè)序的方法進(jìn)行驗(yàn)證。這并不困難。但對(duì)遺傳病家系測(cè)序（無(wú)論是一代測(cè)序還是高通量測(cè)序），所檢出的變異，在功能認(rèn)可上出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果時(shí)有發(fā)生。Bell C.J等 2011年報(bào)道，在406個(gè)已發(fā)表的聲稱引起嚴(yán)重遺傳病的突變中，有122個(gè)（占27%）要么只是一些普通的多態(tài)，要么缺乏致病性的證據(jù)。另外一些報(bào)道則發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照人群中存在不少致病變異。一些報(bào)道的所謂的致病變異被后續(xù)的研究所質(zhì)疑，更多的假陽(yáng)性可能還未被發(fā)現(xiàn)。錯(cuò)誤的、不全面的結(jié)論對(duì)于遺傳病的基礎(chǔ)研究和臨床診療危害非淺。這提示對(duì)測(cè)得的變異或變異所在的基因進(jìn)行功能研究很重要。當(dāng)然，這種對(duì)家系中有些變異的功能的錯(cuò)誤解讀，并非只有高通量測(cè)序才有。需要對(duì)變異所在的基因和變異本身，從遺傳學(xué)、生物信息學(xué)等角度加以考察，并結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)，才能得出與功能（致病性）相關(guān)的結(jié)論。任何致病性方面的結(jié)論得出時(shí)都是需要謹(jǐn)慎考慮的。
結(jié)語(yǔ)
高通量測(cè)序技術(shù)用于遺傳病致病基因的克隆鑒定，是近幾年的事情。它省去了對(duì)基因的作圖定位等煩瑣步驟，省時(shí)省力。在中國(guó)這樣的遺傳資源大國(guó)，該技術(shù)應(yīng)用前景廣闊。本文提到了遺傳病研究采用高通量測(cè)序技術(shù)時(shí)需要注意的一些問(wèn)題，希望對(duì)讀者有所幫助。
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