GOLM1調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究

癌癥的轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。來(lái)自復(fù)旦大學(xué)欽倫秀課題組的研究人員發(fā)現(xiàn)一個(gè)和HCC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因——GOLM1。深入的分子機(jī)制研究顯示，GOLM1作為一個(gè)致癌基因促進(jìn)了肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而這個(gè)過(guò)程是通過(guò)選擇性地與表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR結(jié)合，介導(dǎo)EGFR/RTK 錨定到trans-Gogi network上，促進(jìn)其回收到質(zhì)膜上而激活下游激酶。該研究為深入理解腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制及為轉(zhuǎn)移開發(fā)新的治療方案提供了依據(jù)。

研究背景

轉(zhuǎn)移是腫瘤的一大特征，也是其很難攻克的重要因素之一。已有的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程由復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制。生長(zhǎng)因子反饋受體激酶（RTKs）在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。RTKs的內(nèi)吞和回收機(jī)制，增強(qiáng)了生長(zhǎng)因子對(duì)有絲分裂的控制，這也是癌細(xì)胞的一個(gè)顯著性特點(diǎn)。而RTKs的回收和降解過(guò)程又是受到高爾基體（Golgi）的控制。Golgi相關(guān)的分子是如何具體調(diào)控這個(gè)過(guò)程，又是如何與腫瘤轉(zhuǎn)移聯(lián)系起來(lái)，本研究中這個(gè)角度出發(fā)，為我們?cè)敿?xì)解讀了GOLM1在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用角色。

研究思路

研究結(jié)果

1． HCC轉(zhuǎn)移特異性基因篩選

為了篩選和HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，研究人員利用高通量表達(dá)譜芯片，對(duì)肝外轉(zhuǎn)移組織（EHMH），自由轉(zhuǎn)移肝組織（MFH）和正常肝組織進(jìn)行了全基因組表達(dá)模式差異分析。結(jié)果顯示，一個(gè)編碼高爾基體相關(guān)蛋白GOLPH2的基因——GOLM1，只在EHMH組中特異性顯著上調(diào)。由于高爾基體在蛋白合成和轉(zhuǎn)運(yùn)中的重要作用，研究人員把GOLM1作為候選研究基因。

通過(guò)qRT-PCR和IHC分析，研究人員發(fā)現(xiàn)GOLM1的mRNA和蛋白水平在HCC中，特別是EHMHs中顯著增高。早期復(fù)發(fā)HCCs病人組織中，GOLM1的蛋白水平也明顯高于無(wú)復(fù)發(fā)（RF）病人。因此，GOLM1可能與HCC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

2. GOLM1與HCC病理表征分析

為了進(jìn)一步探究GOLM1與HCC轉(zhuǎn)移的關(guān)系。研究人員運(yùn)用組織芯片對(duì)375個(gè)病人進(jìn)行了GOLM1表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組腫瘤微管侵襲增高，總生存率（OS）低，復(fù)發(fā)（TTR）時(shí)間早。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，高表達(dá)的GOLM1可作為OS和TTR的獨(dú)立診斷指標(biāo)。因此，GOLM1的過(guò)量表達(dá)與HCC的不良預(yù)后密切相關(guān)。

3.GOLM1調(diào)控功能分析

首先，對(duì)不同HCC細(xì)胞系的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MHCC-97H，HCC-LM3，Huh-7細(xì)胞中GOLM1都是高表達(dá)的。同時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)伴隨有高的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在細(xì)胞中用shRNAs人為降低GOLM1表達(dá)（GOLM1-KD），發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的增殖能力有一定抑制作用，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力也有所抑制。再將GOLM1 cDNA轉(zhuǎn)移至GOLM1-KD細(xì)胞，可以補(bǔ)救下調(diào)抑制表型。在GOLM1低表達(dá)細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染上調(diào)GLOM1（GOLM1FLAG），也能限制增加細(xì)胞的增值，侵襲，轉(zhuǎn)移能力。

裸鼠皮下移植模型分析顯示，MHCC-97HshGOLM1組腫瘤大小顯著變小，肺轉(zhuǎn)移也明顯降低。而在小鼠模型中上調(diào)GOLM1可顯著增加腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此，內(nèi)體內(nèi)外的gain-和loss-of-function實(shí)驗(yàn)表明GOLM1對(duì)促進(jìn)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移非常重要。

4. GOLM1作用機(jī)制分析

通過(guò)免疫親和純化和高通量液質(zhì)檢測(cè)（LC-MS/MS），研究人員發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白可以與GOLM1結(jié)合。在不同細(xì)胞中的co-IP實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了他們的結(jié)合關(guān)系。通過(guò)對(duì)EGFR/RTK下游蛋白檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，GOLM1-KD可顯著降低MMP9的表達(dá)。因此，GLOM1可能通過(guò)結(jié)合和激活EGFR/RTK信號(hào)通路，調(diào)控了HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
 

那么，GOLM1和膜蛋白EGFR之間具體是怎么關(guān)聯(lián)的呢？共聚焦顯微觀察顯示，EGF刺激可影響GLOM1的分布，GLOM1從trans-Golgi network(TGN)轉(zhuǎn)移到了胞質(zhì)形成Rab5-positive 囊泡，而和內(nèi)源EGFR共定位。在肝細(xì)胞中可以看到，內(nèi)化的EGFR會(huì)多次和Rab5-positivede GOLM1發(fā)生交互作用。定量co-IP和半定量熒光檢測(cè)顯示在EGF刺激后，兩者之間最多有15-30 min作用時(shí)間。進(jìn)一步的溫度阻遏和釋放等實(shí)驗(yàn)也顯示，GOLM1-KD會(huì)抑制EGFR從TGN到漿膜上。因此，GOLM1可招募EGFR/RTK，進(jìn)而促進(jìn)其胞內(nèi)運(yùn)輸和下游信號(hào)調(diào)控而促進(jìn)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

那么，GOLM1是否影響了EGFR/RTK的內(nèi)吞和回收過(guò)程呢（這對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移非常重要）？結(jié)果顯示，GLOM1-KD可在EGR刺激后增加EGFR的降解，減少EGFR到質(zhì)膜的回收。那么，HCC轉(zhuǎn)移是否以此相關(guān)？研究人員首先尋找了GOLM1和EGFR/RTK互作的區(qū)域，通過(guò)一系列的突變構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)除了△2–12, △5-12, 和 △13-35都可以和EGFR/RTK結(jié)合，點(diǎn)突變G7，R8，R9，M11，K12的GOLM1可以完全抵消掉兩者之間的結(jié)合。進(jìn)一步的GST pull-down實(shí)驗(yàn)也表明GOLM1的胞漿區(qū)域（3-12位氨基酸），可直接綁定到EGFR/RTK上去。

這么這種結(jié)合是否影響了EGFR/RTK的回收和細(xì)胞遷移呢？在HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染突變和刪除片段的GOLM1，EGFR/RTK的回收和細(xì)胞遷移能力減弱。在PLC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GOLM1，EGFR/RTK的回收和細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。因此，正反實(shí)驗(yàn)都顯示，GOLM1影響EGFR/RTK的回收和細(xì)胞遷移能力。

這個(gè)過(guò)程是否和其他蛋白相關(guān)？通過(guò)進(jìn)一步的分析和實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)GLOM1可招募Rab11和EGFR/RTK形成復(fù)合體，返回到細(xì)胞表面而駕馭下游信號(hào)，影響細(xì)胞的侵襲。

通過(guò)構(gòu)建兩個(gè)氨基酸突變株（GOLM1-RVAA和GOLM1TMD），研究人員發(fā)現(xiàn)GOLM1在PLC細(xì)胞中的分泌受到抑制，GOLM1TMD不能與EGFR共定位，EGFR的回收也受到影響。因此，干擾GOLM1的外分泌或高爾基錨定會(huì)減少EGFR的回收，進(jìn)而影響了HCC細(xì)胞的遷移。

研究結(jié)論

該研究通過(guò)前期高通量篩選，找到了和HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因GOLM1，深入的功能和分子作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)顯示，GOLM1通過(guò)選擇性地與表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR結(jié)合，介導(dǎo)EGFR/RTK 錨定到trans-Gogi network上，促進(jìn)其回收到質(zhì)膜上而激活下游激酶，而促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。該研究為我們深入理解腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的證據(jù)。

該研究由伯豪生物提供服務(wù)。

原文出處:
Ye QH, Zhu WW, Zhang JB,et al. GOLM1 Modulates EGFR/RTK Cell-Surface Recycling to Drive Hepatocellular Carcinoma Metastasis. Cancer Cell.2016.