新型冠狀病毒主蛋白酶使用方法
新型冠狀病毒(2019-nCoV)屬于單正鏈的RNA病毒，與SARS-CoV以及MERS-CoV具有較高的同源性，該病毒感染進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在宿主細(xì)胞的幫助下，其遺傳物質(zhì)RNA的ORF1a/b首先翻譯表達(dá)出兩條多聚蛋白前體(pp1a和pp1ab)，多聚蛋白前體在主蛋白酶(main protease, 簡(jiǎn)稱Mpro)和木瓜樣蛋白酶(papain like proteases)的作用下發(fā)生分子內(nèi)的切割產(chǎn)生多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。Mpro也被稱為3C-like protease (3CLpro)，因?yàn)槠淝懈钗稽c(diǎn)的特異性與微小RNA病毒(picornavirus)的3C蛋白酶(3C protease)很相似，兩者并稱為Mpro/3CLpro。多聚蛋白前體產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白參與了病毒亞基因RNA和四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(envelope/E蛋白、membrane/M蛋白、spike/S蛋白和nucleocapsid/N蛋白)的產(chǎn)生，進(jìn)而完成子代病毒的繁衍與釋放。由于Mpro蛋白酶在病毒的生命周期中起到了至關(guān)重要的作用，且人體內(nèi)沒(méi)有同源蛋白，故Mpro主蛋白酶是一個(gè)抗病毒藥物研發(fā)的理想靶點(diǎn)，自2003年SARS爆發(fā)后，已有大量基于Mpro結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的抗SARS藥物的研究。Lopinavir(洛匹那韋)與Ritonavir(利托那韋)等抗HIV藥物也是作用于類似的蛋白酶靶點(diǎn)，并在臨床上得到很好的驗(yàn)證。同時(shí)，Mpro在beta冠狀病毒中保守性高，篩選出的Mpro抑制劑具有一定程度的廣譜抗冠狀病毒能力，甚至可能用于豬冠狀病毒等其它動(dòng)物的疾病治療中。
2019-nCoV Mpro/3CLpro與SARS-CoV的Mpro/3CLpro只差12個(gè)氨基酸，同源性大于96%，兩者結(jié)構(gòu)基本一致。Mpro在介導(dǎo)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，是病毒的重要的理想的藥物靶標(biāo)。2019-nCoV Mpro/3CLpro是自主研發(fā)的PerfectProtein™蛋白表達(dá)技術(shù)平臺(tái)純化而來(lái)，由E.coli重組表達(dá)，沒(méi)有任何額外的標(biāo)簽，沒(méi)有任何一個(gè)額外的氨基酸，確保與2019-nCoV病毒的Mpro/3CLpro氨基酸序列完全一致。
1.具體的使用方法請(qǐng)參考新型冠狀病毒(2019-nCoV) Mpro/3CLpro活性檢測(cè)試劑盒，或者自行參考相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索和優(yōu)化。
2.不同量的2019-nCoV Main Protease(Mpro/3CLpro)酶切 MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2 (冠狀病毒蛋白酶熒光底物) (P9731)生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度參考圖1。
圖1. 2019-nCoV Main Protease (Mpro/3CLpro)酶切MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2底物的效果圖。實(shí)際檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)因樣品和檢測(cè)條件等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
2019-nCoV Mpro/3CLpro與SARS-CoV的Mpro/3CLpro只差12個(gè)氨基酸，同源性大于96%，兩者結(jié)構(gòu)基本一致。Mpro在介導(dǎo)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，是病毒的重要的理想的藥物靶標(biāo)。2019-nCoV Mpro/3CLpro是自主研發(fā)的PerfectProtein™蛋白表達(dá)技術(shù)平臺(tái)純化而來(lái)，由E.coli重組表達(dá)，沒(méi)有任何額外的標(biāo)簽，沒(méi)有任何一個(gè)額外的氨基酸，確保與2019-nCoV病毒的Mpro/3CLpro氨基酸序列完全一致。
| 產(chǎn)品用途(Applications) | 用于新型冠狀病毒抑制劑的篩選、酶活性研究或結(jié)構(gòu)研究 |
| 外觀(Physical appearance) | 液體 |
| 活性(Biological activity) | ≥300U/g或300μmol/min/g |
| 活力單位(Unit definition) | 在pH7.0，溫度37℃條件下，每分鐘催化生成1μmol MCA-AVLQ的酶量定義為一個(gè)單位。 |
| 濃度(Concentration) | ~1mg/ml |
| 純度(Purity) | ≥ 95% by SDS-PAGE. |
| 配方(Formulation) | 500mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 50% Glycerol, pH7.3。 |
| 使用方法(Recommended usage) | 用于抑制劑篩選時(shí)，一般每個(gè)反應(yīng)體系(200μl)約需要0.2-1μg本蛋白酶。 |
| 氨基酸序列(Amino acid sequence) | SGFRKMAFPS GKVEGCMVQV TCGTTTLNGL WLDDVVYCPR HVICTSEDML NPNYEDLLIR KSNHNFLVQA GNVQLRVIGH SMQNCVLKLK VDTANPKTPK YKFVRIQPGQ TFSVLACYNG SPSGVYQCAM RPNFTIKGSF LNGSCGSVGF NIDYDCVSFC YMHHMELPTG VHAGTDLEGN FYGPFVDRQT AQAAGTDTTI TVNVLAWLYA AVINGDRWFL NRFTTTLNDF NLVAMKYNYE PLTQDHVDIL GPLSAQTGIA VLDMCASLKE LLQNGMNGRT ILGSALLEDE FTPFDVVRQC SGVTFQ 備注：本氨基酸序列僅供參考，實(shí)際氨基酸長(zhǎng)度或序列可能有一定變化。 |
1.具體的使用方法請(qǐng)參考新型冠狀病毒(2019-nCoV) Mpro/3CLpro活性檢測(cè)試劑盒，或者自行參考相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索和優(yōu)化。
2.不同量的2019-nCoV Main Protease(Mpro/3CLpro)酶切 MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2 (冠狀病毒蛋白酶熒光底物) (P9731)生成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度參考圖1。
圖1. 2019-nCoV Main Protease (Mpro/3CLpro)酶切MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2底物的效果圖。實(shí)際檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)因樣品和檢測(cè)條件等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
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