組織線粒體使用方法
1. 準(zhǔn)備溶液：室溫融解試劑盒中的各種溶液，融解后立即置于冰上并混勻。第一次使用時，把1.5ml PMSF(溶劑)加入到PMSF(晶體)中，溶解并混勻，即得到1.5ml 100mM PMSF。配制好的100mM PMSF溶液于-20℃保存。如果最終目的是制備線粒體蛋白，根據(jù)樣品數(shù)量，取適量相應(yīng)的線粒體分離試劑備用，在線粒體分離試劑加入到組織樣品中前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。同時，根據(jù)樣品數(shù)量取適量線粒體裂解液備用，在線粒體裂解液加入到線粒體樣品中前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。
2. 從軟組織(例如肝臟和腦)中分離線粒體：
a. 使用新鮮的動物組織，通常要求動物處死后不超過一小時，并且保存在冰上的組織。請勿使用經(jīng)過冷凍保存的組織。
b. 剪取一小塊組織，重量約為50-100mg。在1.5ml離心管內(nèi)對剪取的組織進(jìn)行稱重。用PBS洗滌組織一次。
c. 把組織放在一個置于冰上的離心管或培養(yǎng)皿中，用剪刀或刀片把組織剪切成非常細(xì)小的組織碎片。
d. 加入10體積預(yù)冷的線粒體分離試劑A或臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑A，在冰浴上進(jìn)行勻漿，勻漿10次左右。注：如果組織的重量為80mg，可以大致認(rèn)為組織的體積接近80微升，此時需加入800微升線粒體分離試劑A。
e. 把勻漿在600g，4℃離心5分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為1000g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
f. 小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在11,000g，4℃離心10分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為3500g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
g. 小心去除上清。沉淀即為分離得到的線粒體。
注：如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，在本步驟需收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12000g，4℃離心10分鐘。取上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。該細(xì)胞漿蛋白如果需要測定蛋白濃度，必須使用PBS或生理鹽水至少稀釋2倍，然后才能用BCA法或Bradford法進(jìn)行檢測(須特別注意，標(biāo)準(zhǔn)品也需要配制在含有相應(yīng)比例線粒體分離試劑的PBS或生理鹽水中)。
3. 從硬組織(例如心肌和骨骼肌)中分離線粒體：
a. 對于心肌組織采用線粒體分離試劑A，對于骨骼肌組織采用線粒體分離試劑B，對于其它類似組織可以優(yōu)先考慮使用線粒體分離試劑A，如遇到效果不佳的情況可以試用線粒體分離試劑B。
b. 使用新鮮的動物組織，通常要求動物處死后不超過一小時，并且保存在冰上的組織。請勿使用經(jīng)過冷凍保存的組織。
c. 剪取一小塊組織，重量約為50-100mg。在1.5ml離心管內(nèi)對剪取的組織進(jìn)行稱重。用PBS洗滌組織一次。
d. 把組織放在一個置于冰上的離心管或培養(yǎng)皿中，用剪刀或刀片把組織剪切成非常細(xì)小的組織碎片。
e. 加入10體積預(yù)冷的PBS，冰浴3分鐘。注：如果組織的重量為80mg，可以大致認(rèn)為組織的體積接近80微升，此時需加入800微升PBS。
f. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。
g. 再加入8體積預(yù)冷的胰酶消化液，冰浴20分鐘。
注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約640微升相應(yīng)的胰酶消化液。
h. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。
i. 加入2體積相應(yīng)線粒體分離試劑，重懸組織，用于洗去殘余的胰酶。
注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約160微升線粒體分離試劑。
j. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。
k. 加入8體積預(yù)冷的相應(yīng)線粒體分離試劑或臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑，在冰浴上進(jìn)行勻漿，勻漿20-30次。
注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約640微升相應(yīng)的線粒體分離試劑。
l. 把勻漿在600g，4℃離心5分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為1000g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
m. 小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在11,000g，4℃離心10分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為3500g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
n. 小心去除上清。沉淀即為分離得到的線粒體。
注：如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，在本步驟需收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12,000g，4℃離心10分鐘。取上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。該細(xì)胞漿蛋白如果需要測定蛋白濃度，請參考步驟2g。
4. 線粒體的使用：
a. 如果用于完整線粒體的功能或酶活性研究，可以加入適量線粒體儲存液，重懸線粒體。通常每100mg組織獲得的線粒體可以用40微升相應(yīng)的線粒體儲存液重懸，預(yù)期分離獲得的線粒體樣品的蛋白濃度為10-20mg/ml。該蛋白樣品可以直接使用Bradford法測定蛋白濃度或離心沉淀后裂解再用BCA法測定蛋白濃度。注：線粒體儲存液中含有的DTT會干擾BCA法測定蛋白濃度。
b. 如果用于線粒體的蛋白分析，初始重量為50-100mg的組織樣品分離得到的線粒體樣品中可以加入150-200微升臨用前添加了PMSF的線粒體裂解液裂解線粒體。裂解后的線粒體可以用于PAGE、Western、IP以及線粒體中的一些酶活性的測定等。裂解后的蛋白樣品可以使用BCA法或去垢劑兼容型Bradford法(P0006C)測定蛋白濃度。
c. 如果用于雙向電泳，請使用適當(dāng)?shù)挠糜陔p向電泳的裂解液處理線粒體。
2. 從軟組織(例如肝臟和腦)中分離線粒體：
a. 使用新鮮的動物組織，通常要求動物處死后不超過一小時，并且保存在冰上的組織。請勿使用經(jīng)過冷凍保存的組織。
b. 剪取一小塊組織，重量約為50-100mg。在1.5ml離心管內(nèi)對剪取的組織進(jìn)行稱重。用PBS洗滌組織一次。
c. 把組織放在一個置于冰上的離心管或培養(yǎng)皿中，用剪刀或刀片把組織剪切成非常細(xì)小的組織碎片。
d. 加入10體積預(yù)冷的線粒體分離試劑A或臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑A，在冰浴上進(jìn)行勻漿，勻漿10次左右。注：如果組織的重量為80mg，可以大致認(rèn)為組織的體積接近80微升，此時需加入800微升線粒體分離試劑A。
e. 把勻漿在600g，4℃離心5分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為1000g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
f. 小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在11,000g，4℃離心10分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為3500g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
g. 小心去除上清。沉淀即為分離得到的線粒體。
注：如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，在本步驟需收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12000g，4℃離心10分鐘。取上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。該細(xì)胞漿蛋白如果需要測定蛋白濃度，必須使用PBS或生理鹽水至少稀釋2倍，然后才能用BCA法或Bradford法進(jìn)行檢測(須特別注意，標(biāo)準(zhǔn)品也需要配制在含有相應(yīng)比例線粒體分離試劑的PBS或生理鹽水中)。
3. 從硬組織(例如心肌和骨骼肌)中分離線粒體：
a. 對于心肌組織采用線粒體分離試劑A，對于骨骼肌組織采用線粒體分離試劑B，對于其它類似組織可以優(yōu)先考慮使用線粒體分離試劑A，如遇到效果不佳的情況可以試用線粒體分離試劑B。
b. 使用新鮮的動物組織，通常要求動物處死后不超過一小時，并且保存在冰上的組織。請勿使用經(jīng)過冷凍保存的組織。
c. 剪取一小塊組織，重量約為50-100mg。在1.5ml離心管內(nèi)對剪取的組織進(jìn)行稱重。用PBS洗滌組織一次。
d. 把組織放在一個置于冰上的離心管或培養(yǎng)皿中，用剪刀或刀片把組織剪切成非常細(xì)小的組織碎片。
e. 加入10體積預(yù)冷的PBS，冰浴3分鐘。注：如果組織的重量為80mg，可以大致認(rèn)為組織的體積接近80微升，此時需加入800微升PBS。
f. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。
g. 再加入8體積預(yù)冷的胰酶消化液，冰浴20分鐘。
注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約640微升相應(yīng)的胰酶消化液。
h. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。
i. 加入2體積相應(yīng)線粒體分離試劑，重懸組織，用于洗去殘余的胰酶。
注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約160微升線粒體分離試劑。
j. 600g離心10-20秒，沉淀組織樣品，棄上清。
k. 加入8體積預(yù)冷的相應(yīng)線粒體分離試劑或臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑，在冰浴上進(jìn)行勻漿，勻漿20-30次。
注：如果組織的重量為80mg，此時需加入約640微升相應(yīng)的線粒體分離試劑。
l. 把勻漿在600g，4℃離心5分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為1000g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
m. 小心把上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，在11,000g，4℃離心10分鐘。
注：如需獲得純度更高的線粒體，可以將此步驟的離心速度改為3500g，其它離心條件不變；獲得更高純度線粒體的缺點(diǎn)是相同數(shù)量細(xì)胞的線粒體抽提得率會下降。
n. 小心去除上清。沉淀即為分離得到的線粒體。
注：如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，在本步驟需收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀。隨后把收集的上清12,000g，4℃離心10分鐘。取上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。該細(xì)胞漿蛋白如果需要測定蛋白濃度，請參考步驟2g。
4. 線粒體的使用：
a. 如果用于完整線粒體的功能或酶活性研究，可以加入適量線粒體儲存液，重懸線粒體。通常每100mg組織獲得的線粒體可以用40微升相應(yīng)的線粒體儲存液重懸，預(yù)期分離獲得的線粒體樣品的蛋白濃度為10-20mg/ml。該蛋白樣品可以直接使用Bradford法測定蛋白濃度或離心沉淀后裂解再用BCA法測定蛋白濃度。注：線粒體儲存液中含有的DTT會干擾BCA法測定蛋白濃度。
b. 如果用于線粒體的蛋白分析，初始重量為50-100mg的組織樣品分離得到的線粒體樣品中可以加入150-200微升臨用前添加了PMSF的線粒體裂解液裂解線粒體。裂解后的線粒體可以用于PAGE、Western、IP以及線粒體中的一些酶活性的測定等。裂解后的蛋白樣品可以使用BCA法或去垢劑兼容型Bradford法(P0006C)測定蛋白濃度。
c. 如果用于雙向電泳，請使用適當(dāng)?shù)挠糜陔p向電泳的裂解液處理線粒體。
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組織線粒體分離
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