細(xì)胞活力檢測準(zhǔn)備
1.細(xì)胞的準(zhǔn)備：
使用適合進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測的96孔板，每孔接種100μl細(xì)胞(如使用384孔板，每孔接種25μl細(xì)胞，具體用量視不同類型的384孔板而定)，并確保檢測時每孔的細(xì)胞數(shù)量在5萬個以內(nèi)(如使用384孔板宜控制在1萬個以內(nèi))，同時設(shè)置不含細(xì)胞的培養(yǎng)液孔作為陰性對照，按照細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞。如有需要，可加入藥物處理細(xì)胞。此外，如有必要，也可以設(shè)置細(xì)胞的濃度梯度，以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果。
2.ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置(選做)：
把自備的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻取３醮螜z測可以設(shè)置0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM這幾個濃度，96孔板每孔加入100μl 的標(biāo)準(zhǔn)品。如有必要，在后續(xù)的實驗中可以根據(jù)細(xì)胞中的ATP含量對標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。如果用細(xì)胞培養(yǎng)液來稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋后需立即進(jìn)行后續(xù)的發(fā)光檢測，否則培養(yǎng)液中的ATPase等可以消耗ATP的酶會導(dǎo)致ATP含量下降。
3.檢測試劑的準(zhǔn)備：
a.融解凍存的CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑，如有必要可適當(dāng)分裝該試劑。經(jīng)測試反復(fù)凍融5次對其檢測效果無顯著影響。
b.按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)的量，取適量CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑，平衡至室溫。
4.細(xì)胞活力檢測：
a.取出細(xì)胞培養(yǎng)板在室溫平衡10分鐘(通常不宜超過30分鐘)。
b.96孔板每孔加入100μl CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑(384孔板每孔25μl)。
c.室溫振蕩2分鐘，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解。
d.室溫(約25℃)孵育10分鐘，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定。
e.使用具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。請根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25-1秒或更長時間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
f.根據(jù)化學(xué)發(fā)光讀數(shù)直接計算細(xì)胞的相對活力，或根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出ATP的量從而計算出細(xì)胞的相對活力。對于培養(yǎng)細(xì)胞和ATP標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果可以參考圖1和圖3，細(xì)胞在0-50,000個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，ATP標(biāo)準(zhǔn)品0-10,000nM濃度范圍有良好的線性關(guān)系。注：檢測效果因細(xì)胞的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的細(xì)胞，在細(xì)胞數(shù)量達(dá)到50,000個后可能會不呈現(xiàn)線性相關(guān)，但化學(xué)發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高的。
圖3. CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(CTL Steady Plus)對ATP標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果。實際檢測效果會因檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
常見問題：
1.Luminometer和熒光分光光度計有何不同？
熒光分光光度計檢測的樣品本身不能發(fā)光，樣品需要由特定波長的激發(fā)光激發(fā)，然后才能產(chǎn)生熒光并被熒光分光光度計檢測。Luminometer檢測的樣品本身可以發(fā)光，不需要激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)。也就是說luminometer是檢測化學(xué)發(fā)光(螢光)的儀器。有些型號的熒光分光光度計也具有l(wèi)uminometer的功能，即也可以檢測化學(xué)發(fā)光。您所使用的熒光分光光度計能否用于化學(xué)發(fā)光的測定請仔細(xì)閱讀該儀器的說明書。
2.可以進(jìn)行螢光素酶報告基因檢測的儀器是否就可以用于本試劑盒的檢測？
是。螢光素酶報告基因的檢測原理和本試劑盒的原理相同，可以用相同的儀器測定。
使用適合進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測的96孔板，每孔接種100μl細(xì)胞(如使用384孔板，每孔接種25μl細(xì)胞，具體用量視不同類型的384孔板而定)，并確保檢測時每孔的細(xì)胞數(shù)量在5萬個以內(nèi)(如使用384孔板宜控制在1萬個以內(nèi))，同時設(shè)置不含細(xì)胞的培養(yǎng)液孔作為陰性對照，按照細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞。如有需要，可加入藥物處理細(xì)胞。此外，如有必要，也可以設(shè)置細(xì)胞的濃度梯度，以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果。
2.ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置(選做)：
把自備的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻取３醮螜z測可以設(shè)置0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM這幾個濃度，96孔板每孔加入100μl 的標(biāo)準(zhǔn)品。如有必要，在后續(xù)的實驗中可以根據(jù)細(xì)胞中的ATP含量對標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。如果用細(xì)胞培養(yǎng)液來稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋后需立即進(jìn)行后續(xù)的發(fā)光檢測，否則培養(yǎng)液中的ATPase等可以消耗ATP的酶會導(dǎo)致ATP含量下降。
3.檢測試劑的準(zhǔn)備：
a.融解凍存的CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑，如有必要可適當(dāng)分裝該試劑。經(jīng)測試反復(fù)凍融5次對其檢測效果無顯著影響。
b.按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)的量，取適量CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑，平衡至室溫。
4.細(xì)胞活力檢測：
a.取出細(xì)胞培養(yǎng)板在室溫平衡10分鐘(通常不宜超過30分鐘)。
b.96孔板每孔加入100μl CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法檢測試劑(384孔板每孔25μl)。
c.室溫振蕩2分鐘，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解。
d.室溫(約25℃)孵育10分鐘，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定。
e.使用具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。請根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25-1秒或更長時間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
f.根據(jù)化學(xué)發(fā)光讀數(shù)直接計算細(xì)胞的相對活力，或根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出ATP的量從而計算出細(xì)胞的相對活力。對于培養(yǎng)細(xì)胞和ATP標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果可以參考圖1和圖3，細(xì)胞在0-50,000個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，ATP標(biāo)準(zhǔn)品0-10,000nM濃度范圍有良好的線性關(guān)系。注：檢測效果因細(xì)胞的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的細(xì)胞，在細(xì)胞數(shù)量達(dá)到50,000個后可能會不呈現(xiàn)線性相關(guān)，但化學(xué)發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高的。
常見問題：
1.Luminometer和熒光分光光度計有何不同？
熒光分光光度計檢測的樣品本身不能發(fā)光，樣品需要由特定波長的激發(fā)光激發(fā)，然后才能產(chǎn)生熒光并被熒光分光光度計檢測。Luminometer檢測的樣品本身可以發(fā)光，不需要激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)。也就是說luminometer是檢測化學(xué)發(fā)光(螢光)的儀器。有些型號的熒光分光光度計也具有l(wèi)uminometer的功能，即也可以檢測化學(xué)發(fā)光。您所使用的熒光分光光度計能否用于化學(xué)發(fā)光的測定請仔細(xì)閱讀該儀器的說明書。
2.可以進(jìn)行螢光素酶報告基因檢測的儀器是否就可以用于本試劑盒的檢測？
是。螢光素酶報告基因的檢測原理和本試劑盒的原理相同，可以用相同的儀器測定。
標(biāo)簽：
細(xì)胞活力檢測
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