細胞增殖檢測準備
1.需要用戶自己準備的耗材和試劑a.PBS ，或PBS (pH7.2-7.6)。
b.固定液(免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)。
c.洗滌液(免疫染色封閉液，免疫染色封閉液，或含3% BSA的PBS)。
d.通透液(免疫染色強力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)。
e.去離子水或超純水。
f.根據(jù)實驗要求：18×18mm蓋玻片，6孔板或其它多孔板，或流式細胞分析儀用管子(如12×75mm)。
2.檢測體系的準備
a.如下以6孔板或常規(guī)切片檢測體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測體系可以相應按比例縮小。
b.如果檢測的是懸浮細胞，請按常規(guī)的懸浮細胞的操作方式進行。例如和貼壁細胞相比，相關步驟需要增加離心步驟等，如1000×g室溫離心5min。
3.培養(yǎng)細胞的EdU標記及固定、洗滌和通透
a.在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當數(shù)量的細胞。細胞培養(yǎng)過夜并且恢復到正常狀態(tài)后，進行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b.配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養(yǎng)液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c.將37℃預熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設計終濃度為10μM，原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d.繼續(xù)孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細胞周期10%左右的時間。對于常見的哺乳動物細胞如HeLa、3T3、HEK293等，細胞周期大約在18-25小時，孵育時間宜在2小時左右。人胚胎細胞的細胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘；酵母細胞的細胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經細胞其細胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當降低EdU的濃度。
e.EdU標記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。注：對于流式細胞儀檢測，貼壁細胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸后再固定。
f.去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞3次，每次3-5分鐘。
g.去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h.去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘。
i.轉步驟5。
4.動物體內EdU的標記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進食等適當方式進行動物的體內標記。如下以小鼠為例，其它動物體內EdU的標記請參考相關文獻。
a.對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關，可以參考相關文獻，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進行測試。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨購買。
b.4小時后或根據(jù)特定實驗確定的適當時間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標記的時間也可以參考相關文獻自行調整。
c.對于冰凍切片：
(a)加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。
(b)去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c)去除洗滌液，用適量通透液(可以使用免疫染色強力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d)去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e)抗原修復(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進行抗原修復，可以使用適當?shù)目乖迯鸵�，例如P0090冰凍切片快速抗原修復液(5X)，或者自行配制的適當?shù)目乖迯鸵哼M行抗原修復處理。
(f)轉步驟5。
d.對于石蠟切片：
(a)脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b)抗原修復(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當?shù)目乖迯鸵海鐧幟仕徕c抗原修復液(50X)、改進型檸檬酸鈉抗原修復液(50X)、EDTA抗原修復液(50X)、檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液(40X)、通用型強力抗原修復液(10X)、漂片抗原修復液(10X)，或者自行配制適當?shù)目乖迯鸵哼M行抗原修復處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進行抗原修復，必須反復洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴重干擾后續(xù)標記反應。
(c)轉步驟5。
5.EdU檢測
注意：本步驟六孔板中每孔的反應體系為500μl的反應混合物。對于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應混合物。對于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經適當增加，以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負面影響。對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個切片使用100-200μl的反應混合物。如下以六孔板中的細胞樣品為例說明具體的操作方法，對于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調整即可，其余方法相同。
a.配制Click Additive Solution：對于C0071S，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于C0071L，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當分裝，并-20℃保存。
b.參考下表配制Click反應液。注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制Click反應液，否則點擊反應可能無法有效進行；同時，Click反應液須在配制后15分鐘內使用。
c.去除上一步驟中的洗滌液。
d.每孔加入0.5ml Click反應液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品。
e.室溫避光孵育30分鐘。
f.吸除Click反應液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
g.如果需要對細胞核進行染色，可以參照步驟6進行。如無其它的特殊需要，即可在熒光顯微鏡下觀察，或者使用流式細胞儀、多功能酶標儀進行熒光檢測，或者用高內涵篩選儀器(一般高內涵篩選需要使用染料對細胞核進行染色)進行檢測。Azide 488的最大激發(fā)波長是495nm，最大發(fā)射波長是519nm。
6.細胞核染色
為了檢測細胞增殖的比例，可以考慮使用Hoechst 33342進行細胞核染色。一般高內涵篩選儀器也需要對細胞核進行染色。
a.1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀釋Hoechst 33342 (1000X)。
b.接上述步驟5g，吸除洗滌液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室溫避光孵育10分鐘。
c.吸除1X Hoechst 33342溶液。
d.用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
e.隨后即可進行熒光檢測。Hoechst 33342為藍色熒光，最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm。
7.流式細胞儀檢測
對于經步驟5或6獲得的細胞懸液樣品進行流式檢測。如果使用傳統(tǒng)的流體動力學聚焦的流式細胞儀來測量總DNA含量，請在檢測過程中使用低流速，實驗中的每個樣品應使用相同的收集速率和細胞濃度。EdU標記產生的熒光信號一般使用對數(shù)刻度的橫坐標(如圖4中的橫坐標)。Azide 488的最大激發(fā)波長是495nm，最大發(fā)射波長是519nm。
注1：建議使用未經EdU標記的細胞樣品作為流式細胞儀檢測的陰性對照，并選擇合適的電壓。
注2：由于流式細胞儀檢測比較靈敏，可根據(jù)細胞類型和實際染色情況對Azide 488的使用量進行適當調整。
b.固定液(免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)。
c.洗滌液(免疫染色封閉液，免疫染色封閉液，或含3% BSA的PBS)。
d.通透液(免疫染色強力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)。
e.去離子水或超純水。
f.根據(jù)實驗要求：18×18mm蓋玻片，6孔板或其它多孔板，或流式細胞分析儀用管子(如12×75mm)。
2.檢測體系的準備
a.如下以6孔板或常規(guī)切片檢測體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測體系可以相應按比例縮小。
b.如果檢測的是懸浮細胞，請按常規(guī)的懸浮細胞的操作方式進行。例如和貼壁細胞相比，相關步驟需要增加離心步驟等，如1000×g室溫離心5min。
3.培養(yǎng)細胞的EdU標記及固定、洗滌和通透
a.在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當數(shù)量的細胞。細胞培養(yǎng)過夜并且恢復到正常狀態(tài)后，進行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b.配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養(yǎng)液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c.將37℃預熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設計終濃度為10μM，原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d.繼續(xù)孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細胞周期10%左右的時間。對于常見的哺乳動物細胞如HeLa、3T3、HEK293等，細胞周期大約在18-25小時，孵育時間宜在2小時左右。人胚胎細胞的細胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘；酵母細胞的細胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經細胞其細胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當降低EdU的濃度。
e.EdU標記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。注：對于流式細胞儀檢測，貼壁細胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸后再固定。
f.去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞3次，每次3-5分鐘。
g.去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h.去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘。
i.轉步驟5。
4.動物體內EdU的標記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進食等適當方式進行動物的體內標記。如下以小鼠為例，其它動物體內EdU的標記請參考相關文獻。
a.對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關，可以參考相關文獻，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進行測試。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨購買。
b.4小時后或根據(jù)特定實驗確定的適當時間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標記的時間也可以參考相關文獻自行調整。
c.對于冰凍切片：
(a)加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液，或4%的多聚甲醛)，室溫固定15分鐘。
(b)去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c)去除洗滌液，用適量通透液(可以使用免疫染色強力通透液，免疫染色洗滌液，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d)去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e)抗原修復(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進行抗原修復，可以使用適當?shù)目乖迯鸵�，例如P0090冰凍切片快速抗原修復液(5X)，或者自行配制的適當?shù)目乖迯鸵哼M行抗原修復處理。
(f)轉步驟5。
d.對于石蠟切片：
(a)脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b)抗原修復(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當?shù)目乖迯鸵海鐧幟仕徕c抗原修復液(50X)、改進型檸檬酸鈉抗原修復液(50X)、EDTA抗原修復液(50X)、檸檬酸鈉-EDTA抗原修復液(40X)、通用型強力抗原修復液(10X)、漂片抗原修復液(10X)，或者自行配制適當?shù)目乖迯鸵哼M行抗原修復處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進行抗原修復，必須反復洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴重干擾后續(xù)標記反應。
(c)轉步驟5。
5.EdU檢測
注意：本步驟六孔板中每孔的反應體系為500μl的反應混合物。對于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應混合物。對于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經適當增加，以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負面影響。對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個切片使用100-200μl的反應混合物。如下以六孔板中的細胞樣品為例說明具體的操作方法，對于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調整即可，其余方法相同。
a.配制Click Additive Solution：對于C0071S，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于C0071L，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當分裝，并-20℃保存。
b.參考下表配制Click反應液。注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制Click反應液，否則點擊反應可能無法有效進行；同時，Click反應液須在配制后15分鐘內使用。
| 組分 | 6孔板樣品數(shù) | ||||||
| 1 | 2 | 4 | 5 | 10 | 25 | 50 | |
| Click Reaction Buffer | 430μl | 860μl | 1.72ml | 2.15ml | 4.3ml | 10.75ml | 21.5ml |
| CuSO4 | 20μl | 40μl | 80μl | 100μl | 200μl | 500μl | 1ml |
| Azide 488 | 1μl | 2μl | 4μl | 5μl | 10μl | 25μl | 50μl |
| Click Additive Solution | 50μl | 100μl | 200μl | 250μl | 500μl | 1.25ml | 2.5ml |
| 總體積 | 500μl | 1ml | 2ml | 2.5ml | 5ml | 12.5ml | 25ml |
d.每孔加入0.5ml Click反應液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品。
e.室溫避光孵育30分鐘。
f.吸除Click反應液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
g.如果需要對細胞核進行染色，可以參照步驟6進行。如無其它的特殊需要，即可在熒光顯微鏡下觀察，或者使用流式細胞儀、多功能酶標儀進行熒光檢測，或者用高內涵篩選儀器(一般高內涵篩選需要使用染料對細胞核進行染色)進行檢測。Azide 488的最大激發(fā)波長是495nm，最大發(fā)射波長是519nm。
6.細胞核染色
為了檢測細胞增殖的比例，可以考慮使用Hoechst 33342進行細胞核染色。一般高內涵篩選儀器也需要對細胞核進行染色。
a.1X Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀釋Hoechst 33342 (1000X)。
b.接上述步驟5g，吸除洗滌液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml，室溫避光孵育10分鐘。
c.吸除1X Hoechst 33342溶液。
d.用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
e.隨后即可進行熒光檢測。Hoechst 33342為藍色熒光，最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm。
7.流式細胞儀檢測
對于經步驟5或6獲得的細胞懸液樣品進行流式檢測。如果使用傳統(tǒng)的流體動力學聚焦的流式細胞儀來測量總DNA含量，請在檢測過程中使用低流速，實驗中的每個樣品應使用相同的收集速率和細胞濃度。EdU標記產生的熒光信號一般使用對數(shù)刻度的橫坐標(如圖4中的橫坐標)。Azide 488的最大激發(fā)波長是495nm，最大發(fā)射波長是519nm。
注1：建議使用未經EdU標記的細胞樣品作為流式細胞儀檢測的陰性對照，并選擇合適的電壓。
注2：由于流式細胞儀檢測比較靈敏，可根據(jù)細胞類型和實際染色情況對Azide 488的使用量進行適當調整。
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