細(xì)胞凋亡檢測方法

1. 對于懸浮細(xì)胞：
a. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-FITC的結(jié)合。
b. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
c. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
d. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
e. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中�？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測，可立即上機(jī)檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光，流式檢測細(xì)胞凋亡的效
果及其驗(yàn)證請參考圖1和圖2。初次進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，建議選擇一組適當(dāng)?shù)募?xì)胞參考圖2設(shè)置未染色、PI單染和Annexin V-FITC單染這3個(gè)對照。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測。用于流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC單獨(dú)染色時(shí)出現(xiàn)了過多的PI假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測。
2. 對于貼壁細(xì)胞的消化后檢測：
a. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。注意：對于貼壁細(xì)胞，胰酶消化步驟很關(guān)鍵。胰酶消化時(shí)間如果過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死的假陽性；消化時(shí)間如果過長，同樣易造成細(xì)胞膜損傷而出現(xiàn)細(xì)胞壞死的假陽性，甚至?xí)�影響�?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合從而干擾對于細(xì)胞凋亡的檢測。同時(shí)，胰酶細(xì)胞消化液中應(yīng)盡量不含EDTA，因?yàn)镋DTA可能會(huì)影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。
b. 加入步驟2a中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，把細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：加入步驟2a中的細(xì)胞培養(yǎng)液非常重要，一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC，導(dǎo)致染色失敗。
c. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
d. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
f. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
g. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測，可立即上機(jī)檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光，流式檢測的效果及其驗(yàn)
證請參考圖1和圖2。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測。用于流式細(xì)胞儀檢測時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC單獨(dú)染色時(shí)出現(xiàn)了過多的PI假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS
將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測。
3. 對于貼壁細(xì)胞的原位熒光檢測：
注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a. (選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
b. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。
c. 加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液。
d. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
f. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中�？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。
g. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測。

圖3. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色效果圖。圖中綠色熒光為Annexin V-FITC染色陽性細(xì)胞，紅色熒光為碘化丙啶染色陽性細(xì)胞。僅被綠色熒光染色的為凋亡細(xì)胞，被綠色和紅色熒光雙染的是壞死細(xì)胞，未被熒光染色的為正常細(xì)胞。Vehicle組為陰性對照，Annexin V-FITC染色和碘化丙啶染色都非常弱，L-929細(xì)胞處于正常狀態(tài)；TSZ組為陽性對照，L-929細(xì)胞用TSZ處理3小時(shí)。TSZ為TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細(xì)胞壞死誘導(dǎo)試劑。