NovaSeq™6000和iSeq™ 100測序平臺使用的是有一定數(shù)量納米孔的patterned flowcell,文庫在孔中進(jìn)行簇生成。正是由于這一特點(diǎn),當(dāng)比較同一測序平臺的測序結(jié)果時,不同批次測序之間的原始簇密度是相同的。為了優(yōu)化NovaSeq™ 6000和iSeq™100測序平臺的上樣濃度,可以通過Sequencing Analysis View™ (SAV)軟件繪制% Occupied和% Pass Filter的散點(diǎn)圖來確定測序時上樣濃度屬于過低、最佳,還是過高。
若要查看“% Occupied”數(shù)據(jù),NovaSeq™6000需要SAV版本在v2.4.5以上,iSeq™ 100則需要SAV 版本在v2.4.7以上。SAV安裝程序可以從 Sequencing Analysis Viewer Support 頁面下載:https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/sequencing_analysis_viewer_sav.html
關(guān)于如何創(chuàng)建% Occupied和% Pass Filter散點(diǎn)圖的視頻教程可以在這里找到 ↓↓↓↓
注:% Occupied這一指標(biāo)不適用于Illumina其他測序平臺的數(shù)據(jù)。
繪制% Occupied和% Pass Filter的散點(diǎn)圖
01 將運(yùn)行數(shù)據(jù)加載到SAV中,并選擇Imaging選項卡:
02 從工具欄中選擇散點(diǎn)圖繪圖工具,彈出一個繪圖窗口
03 在窗口右側(cè)的Data選項卡中,“X Values”選擇“% Occupied”,“Y Values”選擇“% Pass Filter”。散點(diǎn)圖將自動生成。
上樣濃度過高:
點(diǎn)有一些輕微的負(fù)斜率、接近垂直,并且% Occupied高達(dá)90以上, % Pass Filter的變化幅度較大。
如果散點(diǎn)圖顯示上樣濃度過低或者過高,則需要分別提高或降低上樣濃度,以達(dá)到最佳上樣濃度。如果散點(diǎn)圖顯示的是最佳上樣濃度,那么在未來測序時類似大小的同一類型的文庫可繼續(xù)使用此上樣濃度。
掃描二維碼查看參考技術(shù)文檔:Cluster Optimization Overview Guide