懸浮培養(yǎng)HEK293細(xì)胞包裝病毒載體的過程優(yōu)化

基因轉(zhuǎn)移的有效性和安全性決定了基因治療的有效性。為了保護(hù)細(xì)胞外環(huán)境中的遺傳物質(zhì)免于降解，必須使用用于基因傳遞的載體系統(tǒng)。其被定義為用于將基因遞送至靶細(xì)胞及其核中的載體。
  一種被廣泛使用的載體類型就是病毒載體，其已經(jīng)進(jìn)化為遞送DNA（如腺相關(guān)病毒AAV）或RNA（如慢病毒LV）以復(fù)制到宿主細(xì)胞中。這些病毒載體都具有各自的優(yōu)勢，可采用貼壁培養(yǎng)、微載體懸浮培養(yǎng)（詳見“應(yīng)用微載體包裝AAV病毒載體”）以及無血清懸浮培養(yǎng)等方式。無論如何，規(guī)�；�生產(chǎn)病毒載體的可靠工藝，都是其臨床轉(zhuǎn)化的重要挑戰(zhàn)。本文以需要采用轉(zhuǎn)染方式包裝病毒載體的LV和AAV為例，概述其懸浮培養(yǎng)HEK293細(xì)胞包裝病毒載體的過程優(yōu)化。
  在此之前，先看一下各個(gè)病毒載體的特點(diǎn)以及外源基因進(jìn)入細(xì)胞的方式。
各個(gè)病毒載體的特點(diǎn)

表1 不同病毒載體的特點(diǎn)
 
外源基因進(jìn)入細(xì)胞的方式
常見轉(zhuǎn)染方法:
· 化學(xué)轉(zhuǎn)染：PEI、脂質(zhì)體（昂貴）
· 物理轉(zhuǎn)染：電穿孔、基因注射、顯微注射（需要設(shè)備）
· 病毒：腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒
對于LV及AAV的轉(zhuǎn)染過程，工業(yè)生產(chǎn)一般使用基于PEI的轉(zhuǎn)染方法。細(xì)胞表面和DNA都帶負(fù)電荷，PEI等轉(zhuǎn)染試劑表面帶正電荷，使用PEI包裹帶負(fù)電荷的DNA，然后穿過帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，進(jìn)行病毒載體的包裝。

圖1 外源基因進(jìn)入細(xì)胞的方式
 
Case1: 懸浮培養(yǎng)HEK293細(xì)胞包裝LV過程優(yōu)化
LV是出芽方式分泌，包裝后的LV一般用于感染免疫細(xì)胞，使其表達(dá)出Car-T細(xì)胞Car的部分。
1、實(shí)驗(yàn)方法
1) 細(xì)胞株：HEK293SF-3F6
2) 反應(yīng)器：一次性攪拌式反應(yīng)器
3) 截留裝置：0.8-0.45 µm
4) 培養(yǎng)方式：采用灌流培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞密度的提高
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
2.1 轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度對病毒滴度的影響
1) 轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度：
LCD：1×106 cells/ml
HCD：5×106cells/ml
2) 采用灌流培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞密度的提高，在使用LC-SFM培養(yǎng)基情況下，每天一個(gè)灌體積的灌流速率，可使細(xì)胞密度達(dá)到1×107  cells/ml，不僅增加了細(xì)胞密度，也移除了代謝副產(chǎn)物如乳酸、氨等。
3) 不管在LCD還是在HCD條件下轉(zhuǎn)染，單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)毒效率都在2 TU/cell左右。
4) 在LCD條件下，轉(zhuǎn)染后3天病毒滴度達(dá)到峰值，約1×106 TU/ml，在HCD條件下，病毒滴度峰值可達(dá)5×106 TU/ml，轉(zhuǎn)染時(shí)較高的細(xì)胞密度可以得到更高的病毒滴度。

病毒梯度，LCD（open bars），HCD（solid bars）。（B）細(xì)胞密度。總細(xì)胞計(jì)數(shù)（squares），活細(xì)胞計(jì)數(shù)（triangles），HCD（solid symbols），LCD（open symbols）
 
2.2 培養(yǎng)基對病毒滴度的影響
1) 優(yōu)化培養(yǎng)基包括某品牌LC-SFM L; LC-SFM GL以及HyClone培養(yǎng)基SFMTransfx-293，代號(hào)HyQ。
2) 在使用LC-SFM L和 LC-SFM GL時(shí)，不論LCD還是HCD條件下，單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)毒效率均為2 TU/ml。
3) 在使用HyQ (SFMTransfx-293)時(shí)，LCD轉(zhuǎn)染條件下有很高的單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)毒效率為6 TU/ml，但是HCD條件下，單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率減少為2 TU/ml，主要是因?yàn)镠CD條件下，細(xì)胞結(jié)團(tuán)嚴(yán)重，并在容器液面邊緣形成一圈死細(xì)胞。造成這個(gè)現(xiàn)象的原因是PEI有一定毒副作用，為了降低PEI的使用量，降低原來1 µg DNA/106cells的使用量，選擇0.4-0.6 µg DNA/106cells的使用量，轉(zhuǎn)染后3天得到最高病毒滴度，為9×106TU/ml。

      圖3 不同類型培養(yǎng)基對LV生產(chǎn)的影響
轉(zhuǎn)染階段：HCD條件下使用LC-SFM L培養(yǎng)基 （solid grey bars）， HCD條件下使用LC-SFM GL培養(yǎng)基 （solid black bars），LCD條件下使用SFMTransfx-293培養(yǎng)基（open bars），HCD條件下使用SFMTransfx-293培養(yǎng)基（hatched bars）
2.3 轉(zhuǎn)染后添加劑丁酸鈉的濃度對病毒滴度的影響
1) 使用HyQ (SFMTransfx-293)培養(yǎng)基，在HCD轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染后16h添加丁酸鈉，優(yōu)化其添加濃度，丁酸鈉優(yōu)化濃度范圍為0.1-5 mM。
2) 轉(zhuǎn)染后丁酸鈉添加量大于2 mM時(shí)，會(huì)降低細(xì)胞密度；隨著丁酸鈉含量的增加，病毒滴度增加。在5 mM丁酸鈉添加量條件下，轉(zhuǎn)染后2天可達(dá)最大病毒滴度，為1×108 TU/ml。

圖4 丁酸鈉不同添加濃度對LV生產(chǎn)的影響，所有實(shí)驗(yàn)組均在SFMTransfx-293培養(yǎng)基中進(jìn)行，在HCD條件下，使用0.4 µg DNA/106cells，丁酸鈉使用量列于圖中。
2.4 懸浮培養(yǎng)HEK293細(xì)胞包裝LV過程優(yōu)化匯總
1) 轉(zhuǎn)染時(shí)，較高的細(xì)胞密度有利于提高病毒滴度；
2) HyClone培養(yǎng)基SFMTransfx-293能夠得到更高的單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)毒效率，但在高密度轉(zhuǎn)染條件下容易結(jié)團(tuán)，需要降低PEI的使用量，建議0.4-0.6 µg DNA/106cells；
3) 轉(zhuǎn)染后丁酸鈉的添加可以增加病毒滴度，但是也容易影響細(xì)胞活性，從而降低活細(xì)胞密度。
4) 通過上述三步優(yōu)化，最終LV病毒滴度從1×106TU/ml提高到1×108TU/ml。
若收毒時(shí)采用灌流的方式，可以得到近一個(gè)數(shù)量級(jí)的病毒量的提升。
表2 過程優(yōu)化對病毒總量（轉(zhuǎn)染后Day4）的影響

Case2: 懸浮培養(yǎng)HEK293細(xì)胞包裝AAV轉(zhuǎn)染過程優(yōu)化
腺相關(guān)病毒（AAV）載體是領(lǐng)先的基因傳遞平臺(tái)，但載體的生產(chǎn)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。需要新的方法來提高AAV的產(chǎn)量并降低成本。過去提高AAV產(chǎn)量的努力集中在一次優(yōu)化單個(gè)變量上，但是這種方法沒有考慮到有助于向量生成的多個(gè)因素的相互作用。在這里，我們利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）方法來優(yōu)化HEK293T懸浮細(xì)胞系統(tǒng)中的rAAV生產(chǎn)。
1、實(shí)驗(yàn)方法

1) 細(xì)胞株：HEK293T
2) 培養(yǎng)基：HyCell TransFx-H
3) 反應(yīng)器：一次性攪拌式反應(yīng)器XDR
4) DoE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
在轉(zhuǎn)染時(shí)活細(xì)胞密度為1×106cells/ml條件下，結(jié)果顯示一組獨(dú)特的參數(shù)，轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的濃度更高，較短的孵育時(shí)間，丁酸鈉的添加等條件，詳述如下：
1) DNA濃度：1 µg/uL，借由案例1可知，高細(xì)胞密度下，可降低此值；
2) PEI/DNA比例：2，較高的比例并不能帶來更好的病毒滴度；
3) 轉(zhuǎn)染體積：5%，過高過低的轉(zhuǎn)染體積均不利于轉(zhuǎn)染效率；
4) 轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育時(shí)間：20 min，過長的孵育時(shí)間，將使復(fù)合物體積變大，不利于其進(jìn)入細(xì)胞；
5) 溫度：37 oC;
6) DNA比例：Rep/cap:helper:transgen plasmid=1:1:2
7) 轉(zhuǎn)染后丁酸鈉的添加：5 mM，過多的丁酸鈉會(huì)造成細(xì)胞活率的降低，但可以顯著提高病毒滴度。

圖5 DoE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：轉(zhuǎn)染條件（溫度、孵育時(shí)間、轉(zhuǎn)染體積、添加劑濃度）對轉(zhuǎn)染效率的影響



圖6 DoE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：轉(zhuǎn)染條件（DNA比例、PEI/DNA比例、DNA濃度、添加劑濃度）對病毒滴度的影響



圖7 轉(zhuǎn)染條件DoE實(shí)驗(yàn)中sweet spot界定


總結(jié)
  規(guī)模化生產(chǎn)病毒載體的可靠工藝，是其臨床轉(zhuǎn)化的重要挑戰(zhàn)，對于需要采用轉(zhuǎn)染方式包裝病毒載體的LV和AAV來說，其懸浮培養(yǎng)的方式將帶來更便利的可放大性，那么對轉(zhuǎn)染階段的條件優(yōu)化，包括轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度，PEI/DNA比例，添加劑的使用等將顯得尤為重要，此時(shí)可采用OFAT單因素法或者DoE的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方式，必要時(shí)可采用灌流的方式用于細(xì)胞密度的擴(kuò)增、代謝副產(chǎn)物的移除以及病毒收獲。