小鼠II型肺泡上皮細胞的分離及流式分選方法

在過去的幾年里，肺泡II型上皮細胞(AECII)在肺免疫調節(jié)的各個方面的貢獻越來越被認識。AECII已被證明參與炎癥氣道中細胞因子的產生，甚至在感染和T細胞介導的自身免疫中作為抗原提呈細胞。


圖1.肺泡上皮由兩種不同的細胞類型組成，肺泡I型和II型細胞

許多關于AEC II功能的研究是使用小鼠或人肺泡上皮細胞系進行的。使用細胞系當然提供了一系列的好處，例如可獲得大量的細胞進行廣泛的分析。然而，使用原代小鼠AECII可以更好地研究其在感染或自身免疫炎癥等復雜過程中的作用。原代小鼠AECII可以直接從患有這種呼吸條件的動物中分離出來，這意味著它們已經(jīng)受到了在分析環(huán)境中發(fā)揮作用的所有額外外部因素的影響。例如，可以從感染甲型流感病毒的小鼠鼻內分離出AECII，甲型流感病毒主要以這些細胞為目標進行復制。重要的是，通過從健康小鼠分離的AECII進行體外感染實驗，可以進一步深入對感染后細胞反應的研究。

該原代小鼠AECII分離方案是基于小鼠肺的酶解，然后用CD11c、CD11b、F4/80、CD19、CD45和CD16/CD32特異性抗體標記細胞，通過流式細胞儀進行細胞分選，AECII確定為未標記和SSC high細胞群。

肺細胞的分離方法
（1）CO2 處死小鼠。注意:不要脫頸處死小鼠，否則會損傷氣管，后續(xù)再進行肺泡灌洗則不能成功；確保痛覺反射的喪失。向小鼠噴上適量乙醇，沿腹中線開腹并小心取出腹膜。
（2）割開小鼠的左右頸靜脈和腎動脈放血，清除組織流動的血液；小心穿刺取出橫膈膜，切掉肋骨，露出心臟和肺。要特別小心，不要損傷肺。
（3）用26G針頭和10ml注射器經(jīng)右心室灌注10ml冷的PBS至肺變白無血。肺部會變白。減少紅血球的數(shù)量對于最終ATII細胞的產量和純度是重要的。
（4）切掉唾液腺，露出氣管。在氣管處通過22G留置針固定導管。（如果需要，在下一步之前，可以通過插入氣管的導管用PBS或培養(yǎng)基沖洗肺部，制備支氣管肺泡灌洗液樣本。）
（5）使用2ml注射器，將2ml的預先恢復至37℃的dispase酶通過導管注入肺，使所有肺葉充分擴張。將注射器更換為1毫升的注射器，其中含有0.5ml的液化瓊脂糖，也注入肺中。將注射器留在導管上，防止瓊脂糖回流，立即用實驗室紙巾和冰塊覆蓋肺部，冷卻幾分鐘。
（6）移除紙巾、冰塊、注射器和導管，切除肺、心臟和胸腺。用PBS沖洗肺，取出心臟、胸腺和剩余的氣管。將肺放入2ml dispase酶中，室溫孵育45分鐘。
（7）將肺從dispase酶中取出，轉移到7ml含有抗CD16 /32抗體(1 μg/ml)和100 μl DNase的DMEM培養(yǎng)基中。用鑷子將肺組織剪碎，室溫200 rpm孵育10分鐘。如果需要，細胞懸液可以在4°C保存，直到下一步。
（8）先用100 μm的細胞篩網(wǎng)過濾細胞懸液，再用70 μm、48 μm和30 μm的篩網(wǎng)進行過濾。將濾液收集到試管中，160 x g 、4°C離心15 min，棄上清液。
（9）將細胞重懸于2ml紅細胞溶解緩沖液中(0.15 M NH4Cl, 0.01 M KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2)，并加入13 ml DMEM培養(yǎng)基快速終止溶解。160 x g、4°C離心12min，棄上清即獲得肺泡上皮細胞。

流式分選II型肺泡上皮細胞
 
圖2.通過陰性選擇流式細胞術分離小鼠AECII的門控策略

當從健康小鼠的肺細胞懸液分選AECII門通常會占所有事件的42±10%。當使用患有呼吸道疾病(如病毒感染)的小鼠時，這一比例會明顯降低，因為最初的細胞懸浮液將包含相當高比例的淋巴細胞和其他招募到呼吸道的免疫細胞。（A）表示細胞分選的邏輯概述；（B）肺細胞懸液的典型圖；（C）分選后細胞的純度。關于分選AECII的存活率，發(fā)現(xiàn)流式分選后的細胞存活率約為90%。這種高比例的活細胞可以直接進行功能分析，也可以對分離的原代小鼠AECII進行短期培養(yǎng)。