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代謝組學(xué)在探究CircACC1的發(fā)現(xiàn)與提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù):1390 發(fā)布日期:2022-11-17  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負


發(fā)表期刊:Cell Metabolism
影響因子:22.415

發(fā)表時間:2019年5月30日
合作單位:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)

Biotree協(xié)助客戶中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)吳緬教授和安徽醫(yī)科大學(xué)胡汪來教授及其研究團隊在國際頂尖期刊《Cell Metabolism》上發(fā)表名為“CircACC1 Regulates Assembly and Activation of AMPK Complex under Metabolic Stress ”的研究成果。CircRNA+代謝組,如何研究才能發(fā)表在IF=22.415的頂級期刊上?下面小趣和大家一起學(xué)習(xí)下這篇文章的精彩之處。

研究背景

AMPK(AMP活化蛋白激酶)是維持能量平衡的重要代謝酶之一,是細胞能量狀態(tài)關(guān)鍵感受器,平衡細胞的合成和分解,在控制脂肪酸氧化、糖酵解和脂解作用中起重要作用。百趣代謝組學(xué)文獻分享,AMPK已在2型糖尿病和代謝綜合征中得到廣泛研究,被視為癌癥治療重要的潛在靶點。目前對于非編碼RNA調(diào)控AMPK的研究有限,已有報道LncRNA參與調(diào)控AMPK,但CircRNA是否參與AMPK調(diào)控卻尚未研究。

研究結(jié)果

1. CircACC1的發(fā)現(xiàn)和鑒定

作者試圖找到與脂質(zhì)代謝相關(guān)的circRNA,首先找出與脂質(zhì)代謝有關(guān)的91個基因,結(jié)合前人研究過的1444個circRNAs,篩選出了6個候選基因,7個circRNAs。然后作者在HCT細胞中用RNA酶消化后,RT-PCR檢測7種circRNAs的表達水平,7種circRNAs都有表達。百趣代謝組學(xué)文獻分享,用siRNA抑制每個circRNA的表達,發(fā)現(xiàn)只有抑制circACC1時會導(dǎo)致脂質(zhì)積累,證明了circACC1與脂質(zhì)代謝相關(guān)。

circACC1是來源于人類17號染色體的ACC1基因,與小鼠序列沒有同源性,后面Northern雜交的試驗也驗證了是環(huán)狀的RNA。用RNase R處理對Total RNA進行qPCR分析,結(jié)果表明circACC1和CDR1未被降解,而β-actin和ACC1 mRNA被降解。百趣代謝組學(xué)文獻分享,Actinomycin D處理結(jié)果也表明circACC1比ACC1 mRNA更穩(wěn)定。這些都證明circACC1確實是環(huán)狀的RNA。

 

圖1. CircACC1的鑒定及參與脂質(zhì)代謝

2.CircACC1促進糖酵解和脂肪酸氧化
為了進一步研究circACC1的功能,作者在LO2(人正常肝細胞系)細胞中敲低circACC1發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)含量升高。相反,在HCT116和LO2中過表達circACC1則脂質(zhì)含量降低。circACC1的敲除或超表達對ACC1 mRNA和ACC1蛋白水平?jīng)]有影響。百趣代謝組學(xué)文獻分享,對circACC1沉默后細胞中的脂質(zhì)成分進行代謝組分析,包括用LC-MS分析脂質(zhì)代謝及GC-MS檢測游離脂肪酸,結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)及游離脂肪酸含量顯著增高。


AMPK是維持能量平衡的重要樞紐,在能量應(yīng)激中,AMPK通過磷酸化PFK-2從而促進糖酵解, 通過磷酸化ACC1抑制脂肪酸合成。敲低circACC1抑制了ACC1和PFKFB3的磷酸化,過表達circACC1促進PFKFB3的磷酸化。沉默circACC1后細胞中ATP、NADPH和胞外乳酸含量均增加,同時增加了ROS水平,而超表達circACC1后結(jié)果完全相反。這些數(shù)據(jù)表明circACC1可以增強AMPK的活性,從而促進糖酵解和脂肪酸的氧化。
 

圖2. CircACC1促進糖酵解和脂肪酸氧化
 

3.CircACC1直接與AMPK的 β 和 γ 亞基結(jié)合

上述結(jié)果表明circACC1可以調(diào)控AMPK,那么它們是如何相互作用的呢?作者進行了進一步研究。FISH試驗表明AMPK和circACC1都存在于細胞質(zhì)中。Pull-down試驗表明AMPK的每一個亞單位都可以用反義探針選擇性地捕獲。百趣代謝組學(xué)文獻分享,RNA免疫沉淀(RIP)分析表明,circACC1與AMPK β1和γ1亞單位有很強的相互作用,但與ɑ1的結(jié)合很小。

在此基礎(chǔ)上,作者進一步研究circACC1與AMPK β1和γ1的相互作用是否與全酶有關(guān)。百趣代謝組學(xué)文獻分享,兩步免疫共沉淀均可檢測到circACC1和AMPK3個亞基。體外EMSA實驗表明只有AMPK β1和γ1能與circACC1進行共沉淀,而ɑ1不能。將P1段拆分為P1和P2兩段,最終研究發(fā)現(xiàn)P1段是circACC1與AMPK β 和 γ 結(jié)合位點。

 

圖3. CircACC1與AMPK的 β 和 γ 亞基直接結(jié)合
 

4.CircACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性

上面的試驗發(fā)現(xiàn)敲低circACC1導(dǎo)致AMPK三個亞基水平均降低,蛋白酶體抑制劑能恢復(fù)因敲低circACC1導(dǎo)致的AMPK水平下調(diào),表明circACC1影響AMPK蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。百趣代謝組學(xué)文獻分享,circACC1敲低顯著降低了AMPK的半衰期,增加AMPK亞基多聚泛素化水平。單獨敲除AMPK的三個亞基會導(dǎo)致其他亞基水平大大降低。用MG132穩(wěn)定蛋白水平后,敲除circACC1后AMPK亞基間結(jié)合能力下降,表明circACC1可以提高AMPK全酶的穩(wěn)定性。作者同時用哺乳動物雙雜交試驗進行進一步驗證,結(jié)果表明circACC1沉默使AMPK β1和γ1結(jié)合作用降低,超表達circACC1使AMPK β1和γ1結(jié)合能力增強。
 

圖4. CircACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性


5. CircACC1直接調(diào)控AMPK的活性

AMPK在維持能量平衡中起著非常重要的調(diào)控作用,可以感知和響應(yīng)細胞能量和營養(yǎng)狀態(tài)的變化。那么不同的應(yīng)激條件是如何影響circACC1的表達呢?RT-PCR結(jié)果分析表明,血清饑餓狀態(tài)能刺激circACC1的表達以及pre-ACC1的生成,但是對成熟circACC1 mRNA的表達水平并無影響。隨后補充血清發(fā)現(xiàn)circACC1的水平也隨之降低,說明circACC1 受到血清水平有效的調(diào)節(jié)。

百趣代謝組學(xué)文獻分享,AMPK的活性受幾種激酶的調(diào)控,包括LKB1,CaMKK2和TAK1。那么circACC1是否是通過這些激酶調(diào)節(jié)AMPK的活性呢?作者對此也進行了研究,敲除LKB1、CaMKK2和TAK1確實能夠降低AMPK和PFKFB3的活性,并降低了ACC1磷酸化。然后分別干涉LKB1、CaMKK2和TAK1,超表達circACC1,發(fā)現(xiàn)AMPK活性增強,而不受三種激酶表達的影響。說明circACC1可以直接調(diào)節(jié)AMPK的活性,而不是通過激酶調(diào)節(jié)。
 

圖5. CircACC1調(diào)控AMPK的活性

6.在血清饑餓狀態(tài)下C-Jun促進CircACC1的表達

對ACC1的啟動子進行分析,有CEBPA、c-Jun、CREB1和SREBF1結(jié)合位點,為了確定這些轉(zhuǎn)錄因子是否參與circACC1的調(diào)控,作者分別對這些轉(zhuǎn)錄因子進行敲除研究,發(fā)現(xiàn)只有c-Jun的沉默會顯著降低circACC1的表達,表明c-Jun參與了circACC1的調(diào)控。百趣代謝組學(xué)文獻分享,隨后作者用CHIP試驗和熒光素酶報告驗證了c-Jun與ACC1啟動子的結(jié)合。血清饑餓后誘導(dǎo)c-Jun激活,JNK和 AMPK信號增強,ACC1的水平降低。干涉c-Jun后AMPK和PFK2活性降低,超表達 circACC1后其活性恢復(fù),這些研究表明c-Jun可促進circACC1的表達,增強AMPK活性。
 

圖6. 在血清饑餓狀態(tài)下C-Jun促進CircACC1的表達
 

7.CircACC1的發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療中的意義

那么circACC1的發(fā)現(xiàn)在腫瘤治療中有什么意義呢?在HCT116細胞中沉默circACC1抑制了細胞的增殖,超表達circACC1促進細胞生長。作者同時也測定了結(jié)腸癌組織及鄰近非癌組織中circACC1表達情況,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織circACC1的表達水平顯著高于正常組織,多數(shù)癌癥組織中c-Jun和AMPK水平也高于正常組織。百趣代謝組學(xué)文獻分享,circACC1的表達與c-Jun和AMPK的活性呈正相關(guān)。
 

圖7. CircACC1在腫瘤發(fā)生中的意義
 

總結(jié)

本研究首先篩選和鑒定與脂質(zhì)代謝相關(guān)的circRNA—circACC1,代謝組方面包括用LC-MS檢測脂質(zhì)代謝組及用GC-MS檢測游離脂肪酸。然后通過基因敲除試驗證實circACC1調(diào)控AMPK,進一步分析circACC1與AMPK相互作用的機理,即circACC1直接與AMPK的 β 和 γ 亞基結(jié)合。百趣代謝組學(xué)文獻分享,基因敲除試驗和哺乳動物雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)circACC1提高AMPK全酶的穩(wěn)定性和活性。作者還對ACC1的啟動子進行分析,發(fā)現(xiàn)c-Jun與ACC1啟動子結(jié)合,c-Jun可促進circACC1的表達。最后探索在腫瘤發(fā)生中的意義,發(fā)現(xiàn)沉默circACC1能抑制了細胞的增殖,結(jié)腸癌組織中circACC1的水平也顯著高于正常組織。百趣代謝組學(xué)文獻分享,本文研究思路嚴謹縝密,試驗設(shè)計環(huán)環(huán)相扣,層層遞進,每步都有充足的試驗驗證,工作量之大讓人嘆服,值得學(xué)習(xí)。

本次研究,BIOTREE協(xié)助老師們進行了經(jīng)典脂質(zhì)組學(xué)及游離脂肪酸高通量靶標定量檢測,文章的最后,老師們也對BIOTREE進行了致謝,謝謝老師們的認可,客戶的認同是BIOTREE前行最大的動力!

 

發(fā)布者:上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司
聯(lián)系電話:021-61531195
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