GenoLab M平臺(tái)全基因組甲基化測(cè)序研究成果發(fā)布

近日，真邁生物在BMC bioinformatics上發(fā)表了題為“Systematic and benchmarking studies of pipelines for mammal WGBS data in the novel NGS platform”的研究成果。該研究在真邁生物GenoLab M高通量測(cè)序平臺(tái)和Illumina的NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序，比較了兩個(gè)平臺(tái)對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞系NCTC1469和人胚胎腎細(xì)胞系293（HEK293）的全基因組甲基化圖譜的差異與影響，并探究了GenoLab M平臺(tái)對(duì)于目前5款常用甲基化分析流程（BSMAP，Bismark，BS Seeker2，BatMeth2，BSBolt）的偏好性。
 
背景介紹
全基因組甲基化測(cè)序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）主要是通過(guò)重亞硫酸鹽將基因組序列中沒(méi)有發(fā)生甲基化的胞嘧啶（Cytosine--C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，再通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)胞嘧啶的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，精確解析每一個(gè)胞嘧啶（C）的甲基化狀態(tài)，從而構(gòu)建全基因組甲基化圖譜，深入探究甲基化胞嘧啶在人類(lèi)疾病、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要作用。
 
結(jié)果概要
1.項(xiàng)目研究概要
本研究采用小鼠肝臟細(xì)胞系和人胚胎腎細(xì)胞系樣本，各有2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，構(gòu)建完甲基化文庫(kù)后，文庫(kù)一分為二，分別在GenoLab M平臺(tái)和NovaSeq 6000平臺(tái)測(cè)序，共獲得8個(gè)下機(jī)數(shù)據(jù)。隨后完成全基因組甲基化分析，解析不同平臺(tái)的甲基化圖譜分布的影響和差異，以及GenoLab M平臺(tái)數(shù)據(jù)的分析軟件偏好。  
2.數(shù)據(jù)質(zhì)控-GenoLab M平臺(tái)數(shù)據(jù)質(zhì)量更好
兩個(gè)平臺(tái)下機(jī)序列（reads）開(kāi)頭和結(jié)尾的幾個(gè)堿基質(zhì)量較低，這會(huì)影響后續(xù)序列在全基因組上的比對(duì)準(zhǔn)確性。因此，我們比較了截取不同長(zhǎng)度堿基后序列的比對(duì)情況。發(fā)現(xiàn)，將read1序列的結(jié)尾和read2序列的開(kāi)頭分別截取掉10個(gè)堿基，可以有效提升全基因組范圍內(nèi)的唯一比對(duì)準(zhǔn)確率，參見(jiàn)圖2 a和c圖。基于上述處理后，我們發(fā)現(xiàn)，同等下機(jī)數(shù)據(jù)情況下，GenoLab M平臺(tái)的有效數(shù)據(jù)產(chǎn)出更多。  
3.甲基轉(zhuǎn)化率平臺(tái)間差異表現(xiàn)和分析軟件偏好類(lèi)似
隨后，我們分別使用了五個(gè)常用的分析軟件進(jìn)行全基因組的比對(duì)分析和甲基化C分布檢測(cè)的平行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GenoLab M平臺(tái)數(shù)據(jù)的重復(fù)序列相對(duì)NovaSeq 6000更低（人3.05% VS 12.38%，鼠2.82% VS 17.24%）。兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)的數(shù)據(jù)使用BSBolt軟件均可獲得最高的唯一比對(duì)率（人94%，小鼠91%）；其次是BetMath2軟件（人91%，小鼠86%）。兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)出數(shù)據(jù)使用BS Seeker2比對(duì)獲取到的唯一比對(duì)率最低。五個(gè)軟件檢測(cè)到的甲基化C占比均為70~80%范圍內(nèi)。  
4.全基因組甲基化圖譜一致性評(píng)估
使用五個(gè)軟件對(duì)兩個(gè)平臺(tái)產(chǎn)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，所有軟件獲取的全基因組范圍內(nèi)CG序列甲基化率分布圖譜（mCGs）均具有較高的一致性，但是CHG和CHH序列甲基化率分布圖譜差異較大。通過(guò)檢測(cè)不同生物學(xué)重復(fù)樣本所有的甲基化C位點(diǎn)（mCs）和CG序列甲基化的C位點(diǎn)（mCGs），我們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于NovaSeq 6000平臺(tái)，GenoLab M平臺(tái)數(shù)據(jù)具有更多的mCs和mCGs位點(diǎn)，且在不同生物學(xué)重復(fù)樣本中，這些mCs和mCGs具有更高的一致性。
 
比較五個(gè)分析軟件所能檢測(cè)到的全基因組C，我們發(fā)現(xiàn)，在生物學(xué)重復(fù)樣本中，BSMAP、BS Seeker2和Bismark獲取到的mCGs的結(jié)果一致性更高，且結(jié)果可以相互驗(yàn)證。綜合比較，BSMAP軟件獲取的結(jié)果相對(duì)來(lái)說(shuō)最好，且耗時(shí)也相對(duì)最少。
   
   
5.mCGs圖譜與早期分析的mCGs圖譜的比較
基于BSMAP軟件獲取的全基因組甲基化圖譜在基因附近的分布分析，我們發(fā)現(xiàn)，不管是在人細(xì)胞系中，還是在小鼠細(xì)胞系中，兩個(gè)平臺(tái)的結(jié)果一致性均較高。通過(guò)與早期已發(fā)表的HEK293細(xì)胞系的全基因組甲基化圖譜結(jié)果比較，并重點(diǎn)關(guān)注了兩個(gè)基因（GNB1和NSUN2）中甲基化位點(diǎn)的分布情況，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)平臺(tái)數(shù)據(jù)集和早期的三個(gè)數(shù)據(jù)集中這兩個(gè)基因的甲基化圖譜一致性均較高。  
 結(jié)論
基于上述全面的分析，我們得出如下結(jié)論：
1 、GenoLab M與NovaSeq 6000兩個(gè)平臺(tái)產(chǎn)出的甲基化數(shù)據(jù)通過(guò)有效截?cái)噙^(guò)濾，可顯著提升序列比對(duì)準(zhǔn)確性；
2 、GenoLab M平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)的重復(fù)序列更低，有效序列更多；
3、 GenoLab M平臺(tái)數(shù)據(jù)包含更多有效的mCs和mCGs位點(diǎn)，且在人和鼠生物學(xué)重復(fù)樣本中，其結(jié)果一致性更高；
4 、五個(gè)常用甲基化分析軟件中，BSMAP的結(jié)果最好，相對(duì)耗時(shí)更短。
 
 討論
甲基化測(cè)序技術(shù)作為研究生命過(guò)程中基因調(diào)控的重要工具，在細(xì)胞分化和疾病進(jìn)展方面得到了廣泛的應(yīng)用，臨床檢測(cè)方面的應(yīng)用也越來(lái)越多。例如：腫瘤早篩-進(jìn)展監(jiān)測(cè)、精準(zhǔn)治療選擇、微小殘留監(jiān)測(cè)、預(yù)后-復(fù)發(fā)檢測(cè)等。目前，有研究發(fā)現(xiàn)，含有游離核酸的體液樣本中可能含有腫瘤特異的DNA甲基化信號(hào)，它們可能是潛在的生物標(biāo)志物。GenoLab M平臺(tái)在本次WGBS全面分析中表現(xiàn)出測(cè)序質(zhì)量更穩(wěn)定、更高，數(shù)據(jù)覆蓋度更深，重復(fù)率更低，甲基化一致性水平更高，準(zhǔn)確率更好等性能，能滿(mǎn)足更多的甲基化測(cè)序項(xiàng)目需求。