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高通量測序后的下游實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法之DNA甲基化篇

瀏覽次數(shù):1184 發(fā)布日期:2023-2-28  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
上一篇,我們分享了DNA甲基化研究的測序數(shù)據(jù)挖掘思路,進(jìn)而鑒定出研究的目的基因或目標(biāo)區(qū)域的DNA甲基化。

做完測序后,如果需要對分析結(jié)果中感興趣的內(nèi)容進(jìn)行后期驗(yàn)證,則需要進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)設(shè)計。DNA甲基化研究的后期驗(yàn)證包括簡單驗(yàn)證、全基因組甲基化干擾實(shí)驗(yàn)(非靶向)、靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等。
 
一、簡單驗(yàn)證
  • 目標(biāo)基因DNA甲基化的驗(yàn)證:Target-BS
  • 檢測目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平:RT-qPCR
  • 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平:Western blot
 

二、全基因組甲基化干擾實(shí)驗(yàn)(非靶向)
  • DNA甲基化干擾:
ü  DNA甲基化酶的敲降/敲除/過表達(dá)
ü  DNA甲基化抑制劑
阿扎胞苷(5-Aza)能夠通過與DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共價鍵抑制其酶活性,使細(xì)胞的DNA甲基化水平降低。
  • 檢測整體DNA甲基化變化:
ü  5mC甲基化免疫熒光染色(定性)
ü  DNA斑點(diǎn)雜交(定性)
ü  比色法(定量)
ü  質(zhì)譜法(定量)
  • 檢測目標(biāo)基因的DNA甲基化變化:Target-BS
  • 檢測目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平:RT-qPCR
  • 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平:Western blot
 
三、靶向目標(biāo)基因的甲基化/去甲基化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
  • 目的基因DNA甲基化的干擾:
ü  熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)(Luciferase activity assay):使用CpG甲基轉(zhuǎn)移酶在體外將質(zhì)粒進(jìn)行甲基化,構(gòu)建含甲基化/未甲基化啟動子的目標(biāo)基因-熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒。
ü  CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化實(shí)驗(yàn):在細(xì)胞中人為表達(dá)目的基因,或通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向編輯DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修飾。
  • 檢測目標(biāo)基因的DNA甲基化變化:Target-BS
  • 檢測目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)水平:RT-qPCR
  • 檢測目標(biāo)基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平:Western blot
  • 檢測細(xì)胞功能受到的影響:
ü  免疫熒光顯微觀察
ü  功能標(biāo)志物測定
ü  ... ...

 

CRISPR-Cas9靶向編輯DNA甲基化技術(shù)
 
目標(biāo)區(qū)域DNA甲基化的驗(yàn)證手段——Target-BS(靶基因重亞硫酸鹽測序)
  • 靶向特定區(qū)域進(jìn)行超高深度甲基化測序。
  • 超高深度:可達(dá)幾百到幾千乘。
  • 單個區(qū)域長度<300bp
  • 需要設(shè)計BS引物,進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。
  • WGBS vs. TBS相當(dāng)于RNA-seq vs. RT-qPCR
 
 
發(fā)布者:深圳市易基因科技有限公司
聯(lián)系電話:0755-28317900
E-mail:wuhuanhuan@e-gene.cn

標(biāo)簽: DNA甲基化
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