空間轉(zhuǎn)錄組報道植物維管組織結構與發(fā)育研究領域新進展中的應用

自空間轉(zhuǎn)錄組被評為2020年nature methods年度技術后，不同的空間組學平臺如雨后春筍般展現(xiàn)在了大眾的視野內(nèi)，其中，10x Genomcs的空間轉(zhuǎn)錄組技術走在了科研的前列，10x Genomcs Visium基于poly(dT)的無偏差RNA捕獲方式給了空間轉(zhuǎn)錄組更廣泛的應用空間和物種適應性。

10X Genomcs Visium從技術建立至今的四年中，絕大多數(shù)的樣本是以人或小鼠等動物為主。但植物相關的空間轉(zhuǎn)錄組文章所見甚少，那么植物和動物的細胞結構和成分差異亦或是在前期植物冰凍切片時的難度可能是阻礙植物使用空間轉(zhuǎn)錄組的難點。

上海伯豪生物的實驗研發(fā)團隊通過查閱相關文獻，實驗條件優(yōu)化摸索，最終在植物樣本的冰凍包埋，切片，樣本透化過程建立了一套伯豪自己的解決方案。并成功在擬南芥、楊樹、 槐樹等多種植物類型中進行相關實驗，積累了豐富的植物空轉(zhuǎn)實驗經(jīng)驗。其中，楊樹是最具代表性的案例。該研究成果由浙江大學生命科學學院杜娟課題組發(fā)表在Molecular Plant上，回答了植物學領域爭論了120年的科學問題：即植物的次生維管組織發(fā)育過程中，韌皮部細胞和木質(zhì)部細胞是來源于一個共同的干細胞中心，還是分別來源于兩個干細胞中心？
 

圖1 楊樹莖次生維管組織中存在兩類干細胞群
分別位于韌皮部與形成層組織
（Pf，韌皮纖維；Ph,韌皮部；CZ,形成層; DX,木質(zhì)部；Pa，薄壁細胞；Ve，導管分子；F，形成層區(qū)紡錘形原始干細胞；R， 形成層區(qū)射線原始細胞；PCL，韌皮部類似干細胞群）

后續(xù)作者運用10x Genomcs Visium空間轉(zhuǎn)錄組學方法，分析了楊樹莖從初生生長到次生生長連續(xù)發(fā)育過程中，原形成層干細胞衍生的子細胞分別分化形成韌皮部干細胞，以及維管形成層干細胞的特征表達的基因（圖2）。
 

圖2 空間轉(zhuǎn)錄組分析與原位雜交驗證次生維管組織中
存在兩個干細胞中心
（PCL，韌皮部干細胞；CZ,形成層干細胞；R， 射線原始細胞）

基于以上三方面實驗數(shù)據(jù)分析的結果，作者進而提出了關于木本植物次生維管系統(tǒng)發(fā)育的一個新的理論模型 （圖3）。
 

圖3 楊樹莖初生維管組織與次生維管組織發(fā)育模式圖

最后作者運用擬時序分析方法，分析了從初生分生組織干細胞到次生分生組織干細胞分化過程中的基因表達規(guī)律（圖4A）；以及兩類次生維管組織干細胞分別分化形成韌皮部細胞與木質(zhì)部細胞過程中的基因表達規(guī)律（圖4B）。
 

圖4 從初生到次生分生組織（A），
及次生分生組織分化過程的基因表達趨勢規(guī)律（B）

本研究首次系統(tǒng)解析了植物次生維管組織干細胞的起源發(fā)生與發(fā)育過程，提供了維管組織干細胞及其衍生細胞在各個分化階段的形態(tài)結構與特征表達基因圖譜，為進一步研究陸生植物維管組織系統(tǒng)演化提供了非常重要的資源。同時也為篩選維管組織發(fā)育與木材形成的關鍵調(diào)控因子進行分子育種，改良植物株型，調(diào)控植物生長發(fā)育與抗逆提供新的研究視角。  

伯豪生物經(jīng)驗
由于植物樣本的特殊性，在前期樣本準備過程中，遇到了比較多的困難，如植物樣本如何進行冰凍包埋，以及植物樣本切片易碎裂的問題，在經(jīng)過了較多次的嘗試與分析后，確定了比較好的樣本收集及切片方法。

同時在后續(xù)實驗過程中，由于植物樣本和動物樣本的差異性，在實驗試劑上也較常規(guī)試劑盒做了更改，例如在樣本透化過程中，由于植物樣本具有細胞壁，很難將mRNA透化出來，所以我們根據(jù)楊樹細胞壁的成分，添加了不同的蛋白酶，去進行預透化。并且，在實驗前期我們也與空轉(zhuǎn)發(fā)明人瑞典科學家Joakim Lundeberg進行了溝通交流，最終確定下適合植物樣本的試劑方案。后續(xù)在數(shù)據(jù)分析過程中，我們也和杜老師多次溝通，摸索出了一套植物空轉(zhuǎn)特有的分析方案。

目前上海伯豪生物在植物空轉(zhuǎn)樣本類型上已經(jīng)有較多的嘗試，如擬南芥、楊樹、 槐樹等植物類型我們都進行過包埋和切片實驗，也都有較豐富的實驗經(jīng)驗。