一種全新的檢測(cè)DNA羥甲基化的技術(shù)：ACE-Seq的介紹

大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑做組學(xué)科研服務(wù)的易基因。今天給大家科普一種全新的檢測(cè)DNA羥甲基化的技術(shù)：APOBEC-coupled epigenetic sequencing，簡(jiǎn)稱【ACE-seq】。

前言
DNA序列中胞嘧啶（C）5’ 碳位結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)而轉(zhuǎn)變成5mC的現(xiàn)象稱為DNA基甲基化。在5mC去甲基化的過(guò)程中，其會(huì)被氧化成5hmC，這種新的修飾稱為DNA羥甲基化。

如圖

因?yàn)?hmC是5mC去甲基化的中間產(chǎn)物，所以對(duì)于多細(xì)胞來(lái)說(shuō)，同一個(gè)C位點(diǎn)上不同細(xì)胞往往會(huì)存在5mC或5hmC不同修飾，而5mC與5hmC對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用又完全不同：?jiǎn)��?dòng)子區(qū)的DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的有抑制作用，DNA羥甲基化則會(huì)促進(jìn)基因的表達(dá)。因此，對(duì)5mC及5hmC的水平進(jìn)行精確地定量并分別研究十分有必要。

了解易基因的小伙伴肯定知道，易基因的看家本領(lǐng)OX-BS技術(shù)可以輕松的開(kāi)展DNA羥甲基化的相關(guān)研究，雖然神器在手，但是不少老師反應(yīng)，OX-BS研究羥甲基化成本還是過(guò)高，因?yàn)楫吘挂獌蓚�(gè)文庫(kù)結(jié)合，180G的測(cè)序數(shù)據(jù)都是白花花的銀子啊。易基因的研發(fā)小伙伴牢記老師們的反饋，日以繼夜的奮戰(zhàn)終于在6月之際。推出新一代羥甲基化研究科研服務(wù)產(chǎn)品‍：APOBEC-coupled epigenetic sequencing ，簡(jiǎn)稱(ACE-seq)。

ACE-seq是一種全新的檢測(cè)DNA羥甲基化的技術(shù)，由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)Emily K Schutsky等在2018年發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上。不同于傳統(tǒng)的BS-Seq，該技術(shù)使用AID/APOBEC家族DNA脫氨酶APOBEC3A (A3A)代替化學(xué)脫氨，保證了DNA的完整性。A3A能夠特異地脫去C及5mC的氨基使其變?yōu)閁，而5hmC則因?yàn)椴槐辉撁缸R(shí)別，測(cè)序時(shí)仍被檢測(cè)為C。這樣，便將5hmC與C及5mC區(qū)分開(kāi)來(lái)。

該技術(shù)原理示意圖如下：

首先，利用T4 β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶（βGT）將5hmC轉(zhuǎn)化成5ghmC，5ghmC不會(huì)被A3A酶脫氨基；然后，利用A3A酶特異去除C和5mC的氨基，使其轉(zhuǎn)變成U，而5hmC保持為C，從而將5hmC和C/5mC區(qū)分開(kāi)來(lái)。

ACE-Seq具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)檢測(cè)范圍為全基因組，可以得到基因組上大部分C位點(diǎn)的羥甲基化水平。
(2)單堿基分辨率。能夠檢測(cè)單個(gè)C堿基的羥甲基化水平，精確度高。
(3)低起始量。ACE-Seq利用脫氨酶實(shí)現(xiàn)5hmC與C及5mC的區(qū)分，反應(yīng)條件溫和，不破壞基因組，大大減少基因組DNA的損失，因此起始DNA量比常規(guī)的oxBS技術(shù)降低100倍。
(4)高準(zhǔn)確性。絕大部分甲基化修飾的C都被轉(zhuǎn)化成U，而絕大部分經(jīng)過(guò)糖基化修飾的5hmC（5ghmC）則保持為C，表明該技術(shù)具有充分的可靠性。

如下圖：

(5)經(jīng)濟(jì)性。僅需一個(gè)文庫(kù)解決問(wèn)題，羥甲基化研究成本大大降低。

ACE-Seq獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)使其在羥甲基化檢測(cè)領(lǐng)域擁有巨大的潛力。‍

為了讓大家全面理解掌握自己究竟該選擇哪種羥甲基化研究技術(shù)，我們?cè)賮?lái)溫習(xí)一下oxWGBS-Seq。該技術(shù)將傳統(tǒng)的BS-Seq技術(shù)與化學(xué)氧化相結(jié)合，先利用高釕酸鉀將DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亞硫酸鹽處理，5fC和沒(méi)有任何修飾的C就被轉(zhuǎn)化成U，而5mC則不會(huì)被轉(zhuǎn)化，仍然保持為C。

原理示意圖如下：

(1)可以同時(shí)檢測(cè)甲基化和羥甲基化的水平。
(2)檢測(cè)范圍為全基因組，可以得到基因組上大部分C位點(diǎn)的甲基化和羥甲基化水平。
(3)單堿基分辨率。能夠檢測(cè)單個(gè)C堿基的甲基化和羥甲基化水平，精確度高。‍

由于以上優(yōu)點(diǎn)，oxWGBS被稱為精準(zhǔn)甲基化和羥甲基化檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

根據(jù)oxWGBS還可以衍生出oxRRBS技術(shù)。oxRRBS是簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序（RRBS-Seq）技術(shù)與化學(xué)氧化技術(shù)的結(jié)合，可以針對(duì)基因組上CpG含量高的區(qū)域（如CGI，啟動(dòng)子等重要的調(diào)控區(qū)域）進(jìn)行甲基化及羥甲基化水平檢測(cè)。由于oxRRBS只針對(duì)CpG含量高的區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，而這些區(qū)域往往是重要的調(diào)控區(qū)域，使得oxRRBS技術(shù)能夠以較低的成本檢測(cè)關(guān)鍵基因組區(qū)域的甲基化及羥甲基化水平。

然而以上兩種技術(shù)有兩個(gè)共同的缺點(diǎn)。

首先，由于重亞硫酸鹽處理對(duì)DNA有強(qiáng)烈的破壞作用，導(dǎo)致建庫(kù)過(guò)程中會(huì)損失大量DNA，因此該技術(shù)需要的DNA起始量較高；另外，由于該技術(shù)需要構(gòu)建兩個(gè)文庫(kù)，會(huì)導(dǎo)致成本的上升。

此外，還可以利用hMeDIP-Seq技術(shù)來(lái)檢測(cè)DNA羥甲基化。hMeDIP利用5hmC特異性抗體富集基因組上發(fā)生羥甲基化的DNA片段，結(jié)合高通量測(cè)序，檢測(cè)基因組上羥甲基化的區(qū)域。

原理示意圖如下：

該技術(shù)針對(duì)羥甲基化的片段進(jìn)行測(cè)序和定量，成本大大降低。但該技術(shù)無(wú)法達(dá)到單堿基分辨率，也無(wú)法得到精確的羥甲基化率，只能得到羥甲基化修飾的信號(hào)強(qiáng)度。

參考文獻(xiàn)：
doi:10.1038/nbt.4204