重組人β-細(xì)胞素在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移研究中的應(yīng)用及案例分享

β 細(xì)胞素（betacellulin）
重組人 β- 細(xì)胞素是通過(guò)大腸桿菌表達(dá)的重組人 betacellulin ，制備出來(lái)的蛋白在 n 端比 betacellulin 序列多了一個(gè)甲硫氨酸。β 細(xì)胞素（betacellulin，簡(jiǎn)稱(chēng) BTC）是表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的一員，在很多器官系統(tǒng)的正常發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，尤其是在胰腺組織中大量表達(dá)，這表明 β 細(xì)胞素可能在胰腺發(fā)育以及胰腺干細(xì)胞分化方面有著重要作用。​

β 細(xì)胞素蛋白
β 細(xì)胞素蛋白（betacellulin，也叫 btc 蛋白）是一種由轉(zhuǎn)基因小鼠的胰腺 β 腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多肽因子 ，通過(guò)對(duì) cdna 的分析，它的全長(zhǎng)氨基酸序列已經(jīng)研究得很清楚了。最開(kāi)始，btc 蛋白被發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)小鼠 3t3 細(xì)胞生長(zhǎng)，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)它對(duì)血管平滑肌細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用。​

在正常生理情況下，人體內(nèi)的 btc 蛋白數(shù)量極少，而且受各種因素限制，從組織里提取非常困難。近些年來(lái)，借助基因工程技術(shù)，已經(jīng)能夠成功生產(chǎn)出數(shù)量較多、價(jià)格相對(duì)便宜的人 btc 蛋白。有報(bào)道顯示，btc 蛋白可用于治療創(chuàng)傷、腫瘤、血管畸形等疾病，還能制成抗體或假性肽競(jìng)爭(zhēng)劑，用來(lái)治療動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病視網(wǎng)膜病變等因平滑肌生長(zhǎng)引發(fā)的疾病。​

在現(xiàn)有的技術(shù)里，制備 btc 蛋白大多采用基因工程方法，主要通過(guò)大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)表達(dá)。以往有報(bào)道稱(chēng)，用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) betacellulin 時(shí)，會(huì)使用含血清的培養(yǎng)基。但血清批次間差異大，成分不一致，導(dǎo)致重組蛋白穩(wěn)定性差，而且血清可能讓表達(dá)的重組蛋白存在病毒風(fēng)險(xiǎn)，不利于后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)。用大腸桿菌表達(dá)時(shí)，會(huì)引入外源融合標(biāo)簽，并且制備過(guò)程中不對(duì)標(biāo)簽進(jìn)行切割去除，外源標(biāo)簽的存在會(huì)嚴(yán)重影響 betacellulin 的結(jié)構(gòu)和功能，致使重組 betacellulin 失去活性，或者產(chǎn)生非預(yù)期的功能。​

案例分享
原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma，簡(jiǎn)稱(chēng) HCC）是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，它發(fā)展速度快，預(yù)后效果差。肝癌很容易在早期就發(fā)生轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致肝癌預(yù)后不好的重要原因，所以研究肝癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是肝癌研究的熱點(diǎn)。β 細(xì)胞素（betacellulin，簡(jiǎn)稱(chēng) BTC）是表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，簡(jiǎn)稱(chēng) EGF）家族的成員之一 。近年來(lái)的研究表明，BTC 可能參與了腫瘤生長(zhǎng)發(fā)展的生物學(xué)過(guò)程。​

研究的目的是探究 BTC 在肝癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)異常情況，以及它對(duì)肝癌的作用和機(jī)制。具體要檢測(cè) BTC 在肝癌細(xì)胞與正常肝細(xì)胞、肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異，明確 BTC 對(duì)肝癌侵襲性的作用，并研究其調(diào)控機(jī)制。​

研究方法如下：​
用 RT-PCR 和 Western blot 技術(shù)，檢測(cè) 4 種肝癌細(xì)胞系（Huh7、HepG2、SMCC - 7721、MHCC97 - H）以及正常肝細(xì)胞系（HL - 7702）中 BTC 的表達(dá)情況。​

采用免疫組化染色的方法，對(duì)比肝癌組織和癌旁組織中 BTC 的表達(dá)，分析其對(duì)肝癌病理特征的影響。​

對(duì) SMCC - 7721、MHCC97 - H 細(xì)胞，一方面用 siRNA 降低 BTC 的表達(dá)，另一方面在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入重組人 BTC 。分別通過(guò) MTT 法以及 Transwell 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，研究 BTC 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，并分析其中的機(jī)制。​

研究結(jié)果如下：​
BTC 在肝癌細(xì)胞系（Huh7、HepG2、SMMC - 7721、MHCC97H）中的表達(dá)量，明顯高于正常肝細(xì)胞系（HL - 7702），而且隨著肝癌細(xì)胞系侵襲能力變強(qiáng)，BTC 表達(dá)量也增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。​

BTC 在肝癌組織及其附近呈現(xiàn)高表達(dá)，當(dāng)腫瘤直徑≥3 厘米，癌組織浸潤(rùn)包膜時(shí)，BTC 表達(dá)也存在差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P<0.05）。​

通過(guò) siRNA 降低 BTC 表達(dá)后，SMCC - 7721 和 MHCC97 - H 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力下降；在培養(yǎng)液中加入 BTC 后，SMCC - 7721 和 MHCC97 - H 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)。并且明確了 BTC 可能通過(guò) PI3K/AKT 信號(hào)通路影響 XIAP 表達(dá)，來(lái)實(shí)現(xiàn)上述調(diào)控。​

結(jié)論
BTC 在肝癌細(xì)胞和肝癌組織中的表達(dá)量，分別高于正常肝細(xì)胞和癌旁組織，與肝癌的病理特征相關(guān)，并且可能通過(guò)激活 PI3K/AKT 信號(hào)通路上調(diào) XIAP 表達(dá)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。