酶標(biāo)儀上細(xì)菌代謝的微生物學(xué)應(yīng)用

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，酶標(biāo)儀是一種應(yīng)用廣泛的實驗室儀細(xì)菌代謝涵蓋了一組復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)，這些化學(xué)反應(yīng)維系著細(xì)菌的生命活動。在微生物學(xué)領(lǐng)域，許多應(yīng)用都依賴于對酶促反應(yīng)的監(jiān)測，或?qū)μ囟ù�謝物、酶濃度以及生命分子過程中所涉及的化學(xué)反應(yīng)的測量。這些應(yīng)用在基礎(chǔ)研究、環(huán)境研究、生物技術(shù)的不同領(lǐng)域，甚至是藥物開發(fā)等方面都具有重要價值。

本文探討了細(xì)菌代謝的范圍、其對研究人員的意義，以及如何利用酶標(biāo)儀進(jìn)行多種代謝應(yīng)用的測定。

1 什么是細(xì)菌代謝？

細(xì)胞從環(huán)境中提取能量，并通過高度整合的化學(xué)反應(yīng)和相互作用網(wǎng)絡(luò)將較小的分子轉(zhuǎn)化為細(xì)胞成分，這一過程被稱為代謝。代謝的基本策略是形成能量和大型分子前體。細(xì)菌代謝指的是在這些生物體內(nèi)發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)。

合成代謝和分解代謝

代謝反應(yīng)可分為合成代謝（anabolic pathways）和分解代謝（catabolic pathways）（圖1）。合成代謝指從簡單分子合成復(fù)雜分子的過程，需要能量輸入。分解代謝則是將碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等復(fù)雜分子分解為更簡單的物質(zhì)（如葡萄糖和氨基酸），并在此過程中釋放能量，以驅(qū)動合成代謝過程。

圖1：分解代謝和合成代謝反應(yīng)

細(xì)菌種類繁多，并進(jìn)化出了多種代謝途徑，使其能適應(yīng)各種環(huán)境。其中一些細(xì)菌可以根據(jù)環(huán)境條件在不同的代謝途徑之間切換，而另一些細(xì)菌則高度專一，適應(yīng)特定且通常要求極為苛刻的環(huán)境。

在細(xì)菌中，一些常見且重要的代謝途徑包括糖酵解（將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸）、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)，涉及碳水化合物、脂肪酸和氨基酸的乙酰輔酶A氧化）、不同類型的發(fā)酵、卡爾文循環(huán)（光合作用的一部分，從二氧化碳合成葡萄糖），以及固氮作用（將分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨）（圖2）。

圖2：細(xì)菌生理的化學(xué)反應(yīng)、代謝過程及代謝途徑的簡化示意圖

微生物代謝類型

細(xì)菌代謝能力涵蓋有氧呼吸、厭氧呼吸、發(fā)酵、光合作用，或通過氧化無機(jī)分子（如氨或硫化.氫）獲取能量的代謝方式。根據(jù)其代謝途徑的不同，微生物可分為不同的代謝類型。例如，異養(yǎng)微生物（heterotrophic microbes）無法自行合成營養(yǎng)物質(zhì)，而是依賴有機(jī)碳來源獲取能量；自養(yǎng)微生物（autotrophic microbes）則可以利用無機(jī)能源（如二氧化碳）合成糖類等儲能物質(zhì)。光無機(jī)營養(yǎng)生物（photolithotrophs）通過氧化無機(jī)基質(zhì)獲取能量，與光有機(jī)營養(yǎng)生物（photoorganotrophs）相似，但其氫供體來源不同。

表1：不同類型的微生物及其營養(yǎng)來源

2 為什么要測量細(xì)菌代謝？

測量細(xì)菌代謝可幫助研究人員掌握多種生物過程，并廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。它們可以為優(yōu)化發(fā)酵過程提供工業(yè)用途，例如用于生產(chǎn)抗生素、酶和燃料的發(fā)酵過程。僅抗微生物藥物耐藥性這一項，就極大地推動了通過了解細(xì)菌代謝和細(xì)菌生長來開發(fā)新型藥物的新方法。此外，代謝研究對于藥物開發(fā)及疾病機(jī)制研究也具有重要意義。

3 酶標(biāo)儀在細(xì)菌代謝研究中的應(yīng)用

研究細(xì)菌代謝的方法多種多樣，以下是幾種常見的實際應(yīng)用，研究人員可直接使用或加以改進(jìn)。

每條代謝途徑的核心是活性酶及其底物轉(zhuǎn)化，因此，酶活性可作為細(xì)菌代謝的良好檢測指標(biāo)。例如，在應(yīng)用報告《通過熒光檢測法監(jiān)測賴氨酸去乙�；�酶活性》中，研究人員使用CycLex SIRT1試劑盒測定大腸桿菌賴氨酸去乙�；�酶CobB的動力學(xué)特性（圖3）。

圖4：大腸桿菌CobB酶動力學(xué)特性測定

細(xì)菌代謝的另一個重要因素是氧化還原酶。NADH/NAD+和NADPH/NADP+是代謝過程的許多氧化還原酶使用的輔助因子，能夠監(jiān)測它們的還原情況，從而提供一種可靠的方法來測量它們的活性。在應(yīng)用說明《ELISA檢測和NADH/NADPH轉(zhuǎn)換檢測》中，BMG LABTECH檢測儀的紫外-可見分光光度計在快速測定氧化和還原煙酰胺輔因子方面的能力得到了強(qiáng)調(diào)（圖5）。NAD+還原為NADH和NADP+還原為NADPH的過程可在340 nm處進(jìn)行監(jiān)測。

圖7：MycoAlert™反應(yīng)的動力學(xué)曲線，其中藍(lán)色代表無支原體的樣品，紅色代表支原體陽性的樣品

氧含量和pH值是細(xì)菌代謝的重要參數(shù)。它們直接影響代謝途徑和特定酶的活性，并可能影響細(xì)菌的生長。測量氧含量和pH值有助于研究人員更好地控制細(xì)菌過程。開放流動呼吸測定法是一種生理相關(guān)方法，可用于測量細(xì)胞呼吸。在應(yīng)用報告《通過實時監(jiān)測細(xì)胞外酸化與耗氧量來測量細(xì)胞代謝變化》中，該系統(tǒng)被轉(zhuǎn)換為96孔微孔板格式，從而能夠在生理相關(guān)大氣條件下實時測量氧和pH水平。該系統(tǒng)是在配備有大氣控制單元的CLARIOstar®酶標(biāo)儀上開發(fā)的（圖8）。該系統(tǒng)在人類細(xì)胞中使用時，可以輕松地用于細(xì)菌。

圖8：在10%氧氣環(huán)境中的耗氧量。含有HepG2細(xì)胞的重復(fù)孔用抗.霉.素.A處理

酶標(biāo)儀具有與細(xì)菌代謝研究特別相關(guān)的功能。這些功能包括將細(xì)菌保持在最佳生長條件下的大氣控制單元和振蕩選項，以及無需人工干預(yù)即可可靠探測各種濃度和信號強(qiáng)度的樣本的動態(tài)范圍擴(kuò)展技術(shù)。

使用96孔、384孔或1536孔微孔板可同時處理多個樣品。實時測量適用于繪制細(xì)菌代謝中可能發(fā)生的動態(tài)變化。例如，這適用于細(xì)菌生長動力學(xué)和酶活性的變化。

酶標(biāo)儀還能夠在各種條件下使用不同的檢測模式進(jìn)行并行測量。因此，多功能酶標(biāo)儀在細(xì)菌代謝的常規(guī)和高級測量中具有速度、可再現(xiàn)性和規(guī)模方面的優(yōu)勢。

4 細(xì)菌代謝應(yīng)用的未來發(fā)展

我們對細(xì)菌代謝的了解仍在不斷增長。因此，隨著全球?qū)嶒炇也粩嘤楷F(xiàn)新的發(fā)現(xiàn)、技術(shù)和應(yīng)用，未來幾年對細(xì)菌代謝測量的需求將繼續(xù)增長。酶標(biāo)儀檢測技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和特定檢測方法的創(chuàng)新應(yīng)成為未來發(fā)展的強(qiáng)大催化劑。
 

廣州進(jìn)科馳安科技有限公司
Bio-Gene Technology Ltd.
熱線：176 2009 3784
www.bio-gene.com.cn
marketing@bio-gene.com.cn
香港 北京 上海 廣州 濟(jì)南