HDX-MS助力揭示FXR-RXRα與SRC1的互作機(jī)制
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▶ 發(fā)表時間：2025年3月13日
▶ 期刊：《Communications Biology》(JCR1區(qū))
▶ 發(fā)表團(tuán)隊：廣州生物醫(yī)藥健康研究院劉勁松研究員
▶ 核心內(nèi)容：該研究使用揭示了FXR-RXRα與SRC1相互作用的分子機(jī)制，提出了首/個包含F(xiàn)XR-RXRα-DNA和SRC1-NRID的多域復(fù)合物模型。研究結(jié)果不僅為理解核受體復(fù)合物的動態(tài)調(diào)控機(jī)制提供了新的視角，還為代謝相關(guān)脂肪性肝病（MAFLD）和代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）的治療提供了新的思路。
研究背景：FXR-RXRα與SRC1相互作用的研究難題
FXR（法尼酯X受體）是一種與代謝紊亂相關(guān)的核受體，其與RXRα形成的異二聚體在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演著重要角色。SRC1作為重要的共激活因子，能夠與FXR-RXRα相互作用，進(jìn)而影響基因表達(dá)。然而，這種相互作用的分子機(jī)制一直未能完全解析。本研究采用HDX-MS表征技術(shù)解決了本研究中最關(guān)鍵的問題，即DNA和激動劑對于FXR-RXRα 和SRC1結(jié)合引起的影響。相對于傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)X-射線衍射難以表征多域結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化以及冷凍電鏡技術(shù)則對樣品的制備要求極高且成本高昂等問題，HDXMS具有其獨(dú)特的優(yōu)勢。
技術(shù)路線與結(jié)論
▷ 首先，研究者們使用生物膜干涉（BLI) 實驗檢測了不同狀態(tài)下FXR-RXRα與SRC1的結(jié)合親和力（KD值）。結(jié)果顯示，激動劑和DNA（hSHP-1) 的結(jié)合顯著影響SRC1與FXR-RXRα的結(jié)合能力，結(jié)合水平在nM水平，表明親和力較高。
▷ 接著，通過整合建模方法預(yù)測FXR-RXRα-hSHP-1可能的互作區(qū)域。
▷ 進(jìn)一步的，通過HDX-MS實驗展示了激動劑和DNA結(jié)合對FXR-RXRα構(gòu)象的影響。結(jié)果顯示，激動劑結(jié)合穩(wěn)定了FXR的LBD，而DNA結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)了這種穩(wěn)定性，并促進(jìn)了LBD和DBD之間的相互作用。
▷ 最后，通過交聯(lián)質(zhì)譜等實驗，進(jìn)一步驗證FXR-RXRα與SRC1互作的精細(xì)互作區(qū)域位于SRC2的NR-box3結(jié)構(gòu)域。
HDX-MS 技術(shù)揭示動態(tài)調(diào)控機(jī)制
HDX-MS技術(shù)能檢測蛋白質(zhì)在不同條件下氫原子與氘原子的交換速率，揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和靈活性。在這項研究中，HDX-MS技術(shù)被用來分析FXR-RXRα在不同狀態(tài)下的構(gòu)象變化，包括與激動劑、DNA結(jié)合后的變化。
實驗設(shè)計： 研究人員制備了三種樣品：未結(jié)合激動劑的FXR-RXRα、結(jié)合激動劑的FXR-RXRα以及結(jié)合激動劑和DNA的FXR-RXRα。所有樣品均在生理條件下進(jìn)行處理，以確保實驗結(jié)果的生理相關(guān)性。
實驗過程：樣品在不同時間點（0秒、10秒、30秒、120秒、600秒和1800秒）進(jìn)行氘化處理，隨后通過質(zhì)譜分析檢測蛋白質(zhì)肽段的氘化程度。實驗重復(fù)三次，以確保結(jié)果的可靠性。
數(shù)據(jù)分析：通過比較不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)肽段的氘化速率，研究人員能夠識別出在激動劑和DNA結(jié)合后發(fā)生顯著構(gòu)象變化的區(qū)域。具體結(jié)果如下：
1. 激動劑結(jié)合的影響：激動劑結(jié)合后，F(xiàn)XR的H3、H4、H6和H12區(qū)域的氘化速率顯著降低，表明這些區(qū)域的結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定。這與激動劑結(jié)合后形成的共激活因子結(jié)合表面的穩(wěn)定化密切相關(guān)。
2. DNA結(jié)合的影響：當(dāng)FXR-RXRα與DNA結(jié)合后，其LBD（配體結(jié)合域）和DBD（DNA結(jié)合域）的氘化速率也發(fā)生了顯著變化。特別是FXR-LBD的H11和H12區(qū)域，其靈活性增加，這可能與共激活因子的招募有關(guān)。
3. 整體構(gòu)象變化：DNA結(jié)合進(jìn)一步穩(wěn)定了FXR-RXRα的異二聚體界面，增強(qiáng)了LBD之間的二聚化，從而促進(jìn)了共激活因子的招募。
HDX-MS 與傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)表征技術(shù)的比較表.HDX-MS 與傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)表征技術(shù)的比較
百蓁團(tuán)隊已與該客戶課題組展開深度合作，利用HDXMS技術(shù)解決蛋白質(zhì)復(fù)合物的精細(xì)結(jié)構(gòu)分析問題，取得了豐碩的成果，發(fā)表JCR1區(qū)高水平文章3篇。
百蓁生物提供全套的 HDX-MS 服務(wù)體系，以發(fā)現(xiàn)各種類型樣品，例如單克隆抗體 (mAb)、抗體-藥物偶聯(lián)物 (ADC)、病毒衣殼、生物仿制藥等蛋白質(zhì)構(gòu)象、動力學(xué)、相互作用的信息，可用于生物仿制藥評價、治療性蛋白質(zhì)QC、藥理學(xué)研究等應(yīng)用領(lǐng)域。百蓁生物HDX-MS 服務(wù)體系優(yōu)勢如下：
百蓁實驗平臺的優(yōu)勢：
a. 低溫精控全自動化樣品前處理系統(tǒng)，低回交率，高重現(xiàn)性，高定量準(zhǔn)確性；實現(xiàn)秒到小時時間尺度的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)精確表征；
b. 搭載Thermo Orbitrap超高分辨三合一質(zhì)譜儀，Top-Down、Middle-Down、Bottom-Up三種分析模式，CID、HCD、ETD多種碎裂方式，提升質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)廣度與覆蓋度；
c. 自主軟件PEAKS®平臺深度解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，獲取更高深度和準(zhǔn)確度肽段信息；
HDX-MS 方法的優(yōu)勢：
a. 蛋白質(zhì)在溶液中處于天然狀態(tài)而非晶體狀態(tài)，直接鑒定蛋白復(fù)合體構(gòu)象；
b. 能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的研究，包括變化中的活性位點及表位；
c. 質(zhì)譜檢測靈敏度高，蛋白質(zhì)樣品用量少（微克級）；對樣品純度要求低；質(zhì)譜分析速度快，極大縮短實驗周期。
數(shù)據(jù)分析與結(jié)果呈現(xiàn)的優(yōu)勢：
a. HDExaminer定量分析結(jié)合人工校準(zhǔn)，精確分析氘摻入量變化趨勢，可完成抗體表位分析、抗體批次間差異效應(yīng)分析、蛋白質(zhì)相互作用分析、蛋白質(zhì)-配體相互作用分析、蛋白質(zhì)動態(tài)結(jié)構(gòu)變化分析等多種需求。
b. 多種可視化結(jié)果呈現(xiàn)方式，并可以通過pyMOL或Chimera渲染到蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，簡潔形象。
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