蛋白互作研究全攻略：常用方法+避坑指南
在生命微觀尺度下，蛋白質(zhì)是極為關鍵的生物大分子，廣泛參與細胞結(jié)構(gòu)維系、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、新陳代謝催化、信號傳導調(diào)控等生命活動，是生命活動的重要基石。蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮依賴蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI），PPI參與細胞內(nèi)眾多生理過程，如基因表達調(diào)控、信號傳導調(diào)控等。以信號傳導為例，細胞接收信號后通過蛋白質(zhì)間有序的相互作用傳遞放大信號，引發(fā)生理響應，因此PPI是細胞正常生理功能實現(xiàn)的核心機制，異常時易引發(fā)多種疾病。探究其作用機制和規(guī)律是生命科學領域的重要課題。
蛋白質(zhì)相互作用可以分為穩(wěn)定相互作用和瞬時相互作用兩種類型。這兩種類型的相互作用均存在強弱差異。
穩(wěn)定相互作用主要存在于多亞基復合物中，這類相互作用可通過免疫共沉淀或Pull down等方法鑒定。
瞬時相互作用參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾、運輸、折疊、信號傳導、細胞周期等多數(shù)生理過程，通常作為生理過程的“分子開關”發(fā)揮臨時調(diào)控作用，其結(jié)合強度可強可弱、作用時間可長可短，但一般需要特定條件觸發(fā)。瞬時相互作用可通過交聯(lián)或標記轉(zhuǎn)移等方法來檢測。
接下來我們一起了解在生命科學研究中檢測蛋白間相互作用的常用方法。
一、酵母雙雜交（Y2H）
（一）技術簡介
酵母雙雜交技術是蛋白互作研究的經(jīng)典方法，起源于20世紀80年代末。它利用酵母轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）的結(jié)構(gòu)特征檢測蛋白互作——這類轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）組成，僅當二者空間靠近時才能激活報告基因轉(zhuǎn)錄。在該系統(tǒng)中，將待檢測的兩種蛋白分別與BD、AD融合，構(gòu)建成誘餌蛋白（BD-靶蛋白）和獵物蛋白（AD-待測蛋白）并導入酵母細胞表達。若兩種蛋白發(fā)生互作，BD與AD將在空間上靠近，使BD結(jié)合到報告基因上游的激活序列（UAS），同時AD激活下游報告基因（如HIS3、LEU2等營養(yǎng)缺陷型基因或β-半乳糖苷酶基因）的轉(zhuǎn)錄。通過觀察酵母在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上的生長情況，或檢測β-半乳糖苷酶的顯色活性（如X-Gal染色），即可判斷蛋白間是否存在互作。
蛋白質(zhì)相互作用可以分為穩(wěn)定相互作用和瞬時相互作用兩種類型。這兩種類型的相互作用均存在強弱差異。
穩(wěn)定相互作用主要存在于多亞基復合物中，這類相互作用可通過免疫共沉淀或Pull down等方法鑒定。
瞬時相互作用參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾、運輸、折疊、信號傳導、細胞周期等多數(shù)生理過程，通常作為生理過程的“分子開關”發(fā)揮臨時調(diào)控作用，其結(jié)合強度可強可弱、作用時間可長可短，但一般需要特定條件觸發(fā)。瞬時相互作用可通過交聯(lián)或標記轉(zhuǎn)移等方法來檢測。
接下來我們一起了解在生命科學研究中檢測蛋白間相互作用的常用方法。
一、酵母雙雜交（Y2H）
（一）技術簡介
酵母雙雜交技術是蛋白互作研究的經(jīng)典方法，起源于20世紀80年代末。它利用酵母轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）的結(jié)構(gòu)特征檢測蛋白互作——這類轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）組成，僅當二者空間靠近時才能激活報告基因轉(zhuǎn)錄。在該系統(tǒng)中，將待檢測的兩種蛋白分別與BD、AD融合，構(gòu)建成誘餌蛋白（BD-靶蛋白）和獵物蛋白（AD-待測蛋白）并導入酵母細胞表達。若兩種蛋白發(fā)生互作，BD與AD將在空間上靠近，使BD結(jié)合到報告基因上游的激活序列（UAS），同時AD激活下游報告基因（如HIS3、LEU2等營養(yǎng)缺陷型基因或β-半乳糖苷酶基因）的轉(zhuǎn)錄。通過觀察酵母在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上的生長情況，或檢測β-半乳糖苷酶的顯色活性（如X-Gal染色），即可判斷蛋白間是否存在互作。
（二）實驗注意事項
1. 在構(gòu)建載體時，要確保融合蛋白的正確表達，避免因基因插入錯誤或表達異常導致實驗失�。�
2. 要對誘餌蛋白進行自激活檢測，防止其自身激活報告基因，產(chǎn)生假陽性結(jié)果；
3. 在篩選文庫時，要設置合適的對照，如陽性對照和陰性對照，以準確判斷實驗結(jié)果；
4. 由于酵母細胞的生長狀態(tài)對實驗結(jié)果有影響，所以要保證酵母感受態(tài)細胞的質(zhì)量，操作過程也要嚴格按照無菌要求進行，防止雜菌污染。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 高通量篩選能力：可從 cDNA 文庫（含數(shù)萬克�。┲写笠�(guī)模篩選互作蛋白，適用構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡；
2. 模擬體內(nèi)環(huán)境：在酵母細胞內(nèi)檢測互作，保留蛋白折疊與核定位等生理條件，適合核蛋白互作分析；
3. 操作簡便：無需純化蛋白，通過報告基因（如營養(yǎng)缺陷、顯色反應）表型篩選，適合實驗室常規(guī)應用；
4. 檢測直接互作：可鑒定蛋白間的直接相互作用，無需依賴第三方因子（如抗體）。
▶局限：
1. 假陽性/假陰性率高：約30%-50%陽性克隆為非特異性互作（如自激活現(xiàn)象），膜蛋白、分泌蛋白等因無法進入細胞核易漏檢；
2. 依賴蛋白表達與定位：核蛋白互作檢測效率高，胞質(zhì)/膜蛋白需進行特殊改造（如使用膜系統(tǒng)酵母雙雜交技術）；
3. 無法檢測動態(tài)互作：報告基因表達需數(shù)小時至數(shù)天，難以捕捉瞬時/弱互作（如信號通路中的動態(tài)結(jié)合）；
4. 物種局限性：哺乳動物蛋白可能因糖基化、磷酸化等翻譯后修飾差異，可能導致互作失敗。
二、免疫共沉淀（Co-IP）
（一）技術簡介
免疫共沉淀（Co-IP）是在細胞裂解液體系中驗證蛋白質(zhì)相互作用的技術，能在細胞內(nèi)天然狀態(tài)下捕獲相互作用的蛋白質(zhì)。其原理是基于抗體對目標蛋白表位的特異性識別。細胞裂解后，向裂解液加入針對目標蛋白的特異性抗體，抗體與目標蛋白結(jié)合形成免疫復合物，再利用能與抗體Fc段特異性結(jié)合的介質(zhì)（如ProteinA/G瓊脂糖珠）沉淀免疫復合物。經(jīng)多次洗滌去除雜質(zhì)蛋白，最后用Western Blotting分析沉淀所得的蛋白復合物，或者使用質(zhì)譜檢測與目標蛋白相互作用的潛在蛋白。
1. 在構(gòu)建載體時，要確保融合蛋白的正確表達，避免因基因插入錯誤或表達異常導致實驗失�。�
2. 要對誘餌蛋白進行自激活檢測，防止其自身激活報告基因，產(chǎn)生假陽性結(jié)果；
3. 在篩選文庫時，要設置合適的對照，如陽性對照和陰性對照，以準確判斷實驗結(jié)果；
4. 由于酵母細胞的生長狀態(tài)對實驗結(jié)果有影響，所以要保證酵母感受態(tài)細胞的質(zhì)量，操作過程也要嚴格按照無菌要求進行，防止雜菌污染。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 高通量篩選能力：可從 cDNA 文庫（含數(shù)萬克�。┲写笠�(guī)模篩選互作蛋白，適用構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡；
2. 模擬體內(nèi)環(huán)境：在酵母細胞內(nèi)檢測互作，保留蛋白折疊與核定位等生理條件，適合核蛋白互作分析；
3. 操作簡便：無需純化蛋白，通過報告基因（如營養(yǎng)缺陷、顯色反應）表型篩選，適合實驗室常規(guī)應用；
4. 檢測直接互作：可鑒定蛋白間的直接相互作用，無需依賴第三方因子（如抗體）。
▶局限：
1. 假陽性/假陰性率高：約30%-50%陽性克隆為非特異性互作（如自激活現(xiàn)象），膜蛋白、分泌蛋白等因無法進入細胞核易漏檢；
2. 依賴蛋白表達與定位：核蛋白互作檢測效率高，胞質(zhì)/膜蛋白需進行特殊改造（如使用膜系統(tǒng)酵母雙雜交技術）；
3. 無法檢測動態(tài)互作：報告基因表達需數(shù)小時至數(shù)天，難以捕捉瞬時/弱互作（如信號通路中的動態(tài)結(jié)合）；
4. 物種局限性：哺乳動物蛋白可能因糖基化、磷酸化等翻譯后修飾差異，可能導致互作失敗。
二、免疫共沉淀（Co-IP）
（一）技術簡介
免疫共沉淀（Co-IP）是在細胞裂解液體系中驗證蛋白質(zhì)相互作用的技術，能在細胞內(nèi)天然狀態(tài)下捕獲相互作用的蛋白質(zhì)。其原理是基于抗體對目標蛋白表位的特異性識別。細胞裂解后，向裂解液加入針對目標蛋白的特異性抗體，抗體與目標蛋白結(jié)合形成免疫復合物，再利用能與抗體Fc段特異性結(jié)合的介質(zhì)（如ProteinA/G瓊脂糖珠）沉淀免疫復合物。經(jīng)多次洗滌去除雜質(zhì)蛋白，最后用Western Blotting分析沉淀所得的蛋白復合物，或者使用質(zhì)譜檢測與目標蛋白相互作用的潛在蛋白。
（二）實驗注意事項
1. 抗體選擇：使用高特異性、高親和力的IP抗體，可通過Western blot預實驗檢測抗體對目標蛋白的表位識別能力，驗證無明顯非特異性條帶。需根據(jù)抗體種屬選擇匹配的 Protein A/G 介質(zhì)，避免因Fc段結(jié)合效率低導致沉淀失敗。
2. 樣品制備：使用新鮮細胞或組織（避免反復凍融），根據(jù)目標蛋白選擇裂解液（如NP-40或RIPA），添加蛋白酶/磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解或修飾丟失，裂解后迅速離心取上清，去除細胞碎片。
3. 對照設置：陰性對照：同型IgG或空載體轉(zhuǎn)基因材料；Input對照：驗證目標蛋白在樣品中表達。
4. 結(jié)合條件優(yōu)化：調(diào)整抗體和磁珠/瓊脂糖的比例，避免過量抗體導致非特異性結(jié)合，優(yōu)化孵育時間（通常4℃過夜）和溫度。
5. 洗滌條件：根據(jù)實驗調(diào)整洗滌緩沖液鹽濃度，如用含 Triton X-100的低鹽/高鹽緩沖液（如PBS+0.1%Triton X-100）梯度洗滌，去除非特異性結(jié)合，同時避免強洗滌條件破壞蛋白復合物。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 生理相關性強：在細胞內(nèi)天然狀態(tài)下檢測蛋白互作，保留翻譯后修飾（如磷酸化、泛素化）和亞細胞定位信息，更貼近生理環(huán)境（區(qū)別于體外Pull-down技術）。
2. 樣本適用性廣：可用于細胞裂解液、組織樣本（如冰凍/石蠟切片組織提取液），甚至轉(zhuǎn)基因動物的體液樣本，兼容內(nèi)源蛋白和外源表達蛋白的檢測。
3. 操作兼容性高：結(jié)合質(zhì)譜（MS）可篩選未知互作蛋白，構(gòu)建互作網(wǎng)絡，通過WB能特異性驗證已知互作蛋白。
▶局限：
1. 間接互作干擾：檢測到的蛋白復合物可能是通過第三方因子連接的間接結(jié)合，無法直接證明兩蛋白的物理結(jié)合，需結(jié)合體外Pull-down實驗或酵母雙雜交驗證直接互作。
2. 低豐度蛋白限制：對低表達蛋白的敏感性不足，需要增加樣本投入量或借助交聯(lián)劑固定（但可能增加非特異性結(jié)合風險）。
3. 抗體依賴性強：抗體質(zhì)量直接影響結(jié)果，可能漏檢某些互作（如表位被遮蔽）或產(chǎn)生假陽性（非特異性結(jié)合）。
4. 動態(tài)互作捕捉難：難以捕獲瞬時或弱相互作用（如激酶-底物的短暫結(jié)合），需優(yōu)化孵育時間或使用交聯(lián)劑（如甲醛）固定。
三、蛋白Pull-down
（一）技術簡介
Pull-down實驗是體外研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，基于親和層析原理，能捕獲并鑒定與目標蛋白（誘餌蛋白）相互作用的其他蛋白。流程為：先將誘餌蛋白與特定標簽（如GST、His、Halo、Flag等）融合表達，利用親和層析純化融合蛋白，隨后，將純化的融合蛋白通過標簽與固相支持物上配體特異性結(jié)合（如GST融合蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖珠結(jié)合），形成固定化的誘餌蛋白。然后將含獵物蛋白的細胞裂解液或蛋白溶液，與固定化誘餌蛋白孵育，通過洗去未結(jié)合蛋白，捕獲具有相互作用的蛋白復合物。最后洗脫分離結(jié)合的蛋白復合物，可使用Western Blotting驗證已知互作蛋白或質(zhì)譜分析篩選未知互作蛋白。
1. 抗體選擇：使用高特異性、高親和力的IP抗體，可通過Western blot預實驗檢測抗體對目標蛋白的表位識別能力，驗證無明顯非特異性條帶。需根據(jù)抗體種屬選擇匹配的 Protein A/G 介質(zhì)，避免因Fc段結(jié)合效率低導致沉淀失敗。
2. 樣品制備：使用新鮮細胞或組織（避免反復凍融），根據(jù)目標蛋白選擇裂解液（如NP-40或RIPA），添加蛋白酶/磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解或修飾丟失，裂解后迅速離心取上清，去除細胞碎片。
3. 對照設置：陰性對照：同型IgG或空載體轉(zhuǎn)基因材料；Input對照：驗證目標蛋白在樣品中表達。
4. 結(jié)合條件優(yōu)化：調(diào)整抗體和磁珠/瓊脂糖的比例，避免過量抗體導致非特異性結(jié)合，優(yōu)化孵育時間（通常4℃過夜）和溫度。
5. 洗滌條件：根據(jù)實驗調(diào)整洗滌緩沖液鹽濃度，如用含 Triton X-100的低鹽/高鹽緩沖液（如PBS+0.1%Triton X-100）梯度洗滌，去除非特異性結(jié)合，同時避免強洗滌條件破壞蛋白復合物。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 生理相關性強：在細胞內(nèi)天然狀態(tài)下檢測蛋白互作，保留翻譯后修飾（如磷酸化、泛素化）和亞細胞定位信息，更貼近生理環(huán)境（區(qū)別于體外Pull-down技術）。
2. 樣本適用性廣：可用于細胞裂解液、組織樣本（如冰凍/石蠟切片組織提取液），甚至轉(zhuǎn)基因動物的體液樣本，兼容內(nèi)源蛋白和外源表達蛋白的檢測。
3. 操作兼容性高：結(jié)合質(zhì)譜（MS）可篩選未知互作蛋白，構(gòu)建互作網(wǎng)絡，通過WB能特異性驗證已知互作蛋白。
▶局限：
1. 間接互作干擾：檢測到的蛋白復合物可能是通過第三方因子連接的間接結(jié)合，無法直接證明兩蛋白的物理結(jié)合，需結(jié)合體外Pull-down實驗或酵母雙雜交驗證直接互作。
2. 低豐度蛋白限制：對低表達蛋白的敏感性不足，需要增加樣本投入量或借助交聯(lián)劑固定（但可能增加非特異性結(jié)合風險）。
3. 抗體依賴性強：抗體質(zhì)量直接影響結(jié)果，可能漏檢某些互作（如表位被遮蔽）或產(chǎn)生假陽性（非特異性結(jié)合）。
4. 動態(tài)互作捕捉難：難以捕獲瞬時或弱相互作用（如激酶-底物的短暫結(jié)合），需優(yōu)化孵育時間或使用交聯(lián)劑（如甲醛）固定。
三、蛋白Pull-down
（一）技術簡介
Pull-down實驗是體外研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，基于親和層析原理，能捕獲并鑒定與目標蛋白（誘餌蛋白）相互作用的其他蛋白。流程為：先將誘餌蛋白與特定標簽（如GST、His、Halo、Flag等）融合表達，利用親和層析純化融合蛋白，隨后，將純化的融合蛋白通過標簽與固相支持物上配體特異性結(jié)合（如GST融合蛋白與谷胱甘肽瓊脂糖珠結(jié)合），形成固定化的誘餌蛋白。然后將含獵物蛋白的細胞裂解液或蛋白溶液，與固定化誘餌蛋白孵育，通過洗去未結(jié)合蛋白，捕獲具有相互作用的蛋白復合物。最后洗脫分離結(jié)合的蛋白復合物，可使用Western Blotting驗證已知互作蛋白或質(zhì)譜分析篩選未知互作蛋白。
（二）實驗注意事項
1. 蛋白表達純化：根據(jù)需求選擇原核（如E.coli，表達需注意蛋白可溶性，避免包涵體形成）或者真核（如HEK293、昆蟲細胞等，適合復雜修飾的蛋白）表達系統(tǒng)。
2. 樣本制備：裂解液的成分需根據(jù)研究對象進行優(yōu)化，過高濃度的去垢劑可能破壞蛋白-配體的相互作用，樣本需充分離心或過濾，去除細胞碎片等雜質(zhì)。
3. 配體與基質(zhì)選擇：配體的親和力和特異性直接影響實驗結(jié)果，需通過預實驗篩選最佳配體；基質(zhì)應選擇非特異性吸附低的類型，并嚴格控制配體的偶聯(lián)效率和密度。
4. 對照設置：設置陰性對照（如空載表達的蛋白或無關配體），陽性對照（已知與配體結(jié)合的蛋白），input對照（同步檢測目標蛋白表達量，確保樣本制備一致性），以確保實驗結(jié)果的可靠性。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 無需抗體：僅需將誘餌蛋白標記（如GST、His等標簽），避免因抗體特異性差或者制備困難導致的實驗阻礙，尤其適用于無商業(yè)化抗體的蛋白研究。
2. 靈活性高：可精準設計誘餌蛋白的突變體、結(jié)構(gòu)域或翻譯后修飾（如磷酸化位點突變），研究結(jié)構(gòu)、修飾等對互作的影響。
3. 樣本兼容性廣：適用于原核/真核表達蛋白、細胞裂解液、合成多肽（如抗原表位肽），或者化學合成的小分子配體。
4. 應用范圍廣：可用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、小分子化合物、核酸等多種配體的相互作用，在藥物靶點發(fā)現(xiàn)、信號通路機制研究等領域具有重要應用價值。
▶局限：
1. 非特異性背景干擾：配體或基質(zhì)可能非特異性吸附蛋白，導致假陽性信號。需通過陰性對照（空標簽基質(zhì)）和BSA封閉基質(zhì)降低背景。
2. 低豐度蛋白檢測困難：對于細胞內(nèi)低表達的蛋白質(zhì)，由于親和捕獲效率有限，可能難以有效富集，影響檢測靈敏度。
3. 無法區(qū)分直接與間接相互作用：實驗捕獲的蛋白復合物中，可能包含與目標蛋白間接結(jié)合的蛋白，需要進一步進行點對點實驗來驗證兩蛋白是否直接互作。
4. 動態(tài)互作捕捉難：體外孵育時間通常 2-4 小時，無法模擬細胞內(nèi)瞬時互作（如激酶 - 底物結(jié)合僅數(shù)秒）。
5. 表達系統(tǒng)限制：原核表達缺乏真核修飾（如糖基化），可能影響互作真實性，可采用無細胞真核表達系統(tǒng)保留翻譯后修飾。藍景科信為您提供無細胞真核表達系統(tǒng)選擇，表達成功率高，周期短，表達蛋白更接近體內(nèi)蛋白情況。
四、雙分子熒光互補（BiFC）
（一）技術簡介
雙分子熒光互補（BiFC）技術能直觀、快速地判斷目標蛋白在活細胞中的定位和相互作用。其原理是將熒光蛋白（如綠色熒光蛋GFP、黃色熒光蛋YFP 等）在特定位點分割成無熒光活性的N端和C端片段，再將這兩個片段分別與待測的兩種目標蛋白融合，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化導入活細胞表達。當目標蛋白發(fā)生相互作用時，會帶動兩個熒光蛋白片段靠近重組，恢復熒光活性并發(fā)光。借助熒光顯微鏡能直接觀測熒光信號在細胞內(nèi)的位置和強度，從而確定蛋白間的相互關系及其亞細胞定位。
1. 蛋白表達純化：根據(jù)需求選擇原核（如E.coli，表達需注意蛋白可溶性，避免包涵體形成）或者真核（如HEK293、昆蟲細胞等，適合復雜修飾的蛋白）表達系統(tǒng)。
2. 樣本制備：裂解液的成分需根據(jù)研究對象進行優(yōu)化，過高濃度的去垢劑可能破壞蛋白-配體的相互作用，樣本需充分離心或過濾，去除細胞碎片等雜質(zhì)。
3. 配體與基質(zhì)選擇：配體的親和力和特異性直接影響實驗結(jié)果，需通過預實驗篩選最佳配體；基質(zhì)應選擇非特異性吸附低的類型，并嚴格控制配體的偶聯(lián)效率和密度。
4. 對照設置：設置陰性對照（如空載表達的蛋白或無關配體），陽性對照（已知與配體結(jié)合的蛋白），input對照（同步檢測目標蛋白表達量，確保樣本制備一致性），以確保實驗結(jié)果的可靠性。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 無需抗體：僅需將誘餌蛋白標記（如GST、His等標簽），避免因抗體特異性差或者制備困難導致的實驗阻礙，尤其適用于無商業(yè)化抗體的蛋白研究。
2. 靈活性高：可精準設計誘餌蛋白的突變體、結(jié)構(gòu)域或翻譯后修飾（如磷酸化位點突變），研究結(jié)構(gòu)、修飾等對互作的影響。
3. 樣本兼容性廣：適用于原核/真核表達蛋白、細胞裂解液、合成多肽（如抗原表位肽），或者化學合成的小分子配體。
4. 應用范圍廣：可用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、小分子化合物、核酸等多種配體的相互作用，在藥物靶點發(fā)現(xiàn)、信號通路機制研究等領域具有重要應用價值。
▶局限：
1. 非特異性背景干擾：配體或基質(zhì)可能非特異性吸附蛋白，導致假陽性信號。需通過陰性對照（空標簽基質(zhì)）和BSA封閉基質(zhì)降低背景。
2. 低豐度蛋白檢測困難：對于細胞內(nèi)低表達的蛋白質(zhì)，由于親和捕獲效率有限，可能難以有效富集，影響檢測靈敏度。
3. 無法區(qū)分直接與間接相互作用：實驗捕獲的蛋白復合物中，可能包含與目標蛋白間接結(jié)合的蛋白，需要進一步進行點對點實驗來驗證兩蛋白是否直接互作。
4. 動態(tài)互作捕捉難：體外孵育時間通常 2-4 小時，無法模擬細胞內(nèi)瞬時互作（如激酶 - 底物結(jié)合僅數(shù)秒）。
5. 表達系統(tǒng)限制：原核表達缺乏真核修飾（如糖基化），可能影響互作真實性，可采用無細胞真核表達系統(tǒng)保留翻譯后修飾。藍景科信為您提供無細胞真核表達系統(tǒng)選擇，表達成功率高，周期短，表達蛋白更接近體內(nèi)蛋白情況。
四、雙分子熒光互補（BiFC）
（一）技術簡介
雙分子熒光互補（BiFC）技術能直觀、快速地判斷目標蛋白在活細胞中的定位和相互作用。其原理是將熒光蛋白（如綠色熒光蛋GFP、黃色熒光蛋YFP 等）在特定位點分割成無熒光活性的N端和C端片段，再將這兩個片段分別與待測的兩種目標蛋白融合，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或者農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化導入活細胞表達。當目標蛋白發(fā)生相互作用時，會帶動兩個熒光蛋白片段靠近重組，恢復熒光活性并發(fā)光。借助熒光顯微鏡能直接觀測熒光信號在細胞內(nèi)的位置和強度，從而確定蛋白間的相互關系及其亞細胞定位。
（二）實驗注意事項
1. 載體設計優(yōu)化：在目標蛋白與熒光片段之間添加柔性連接肽，通過增加空間自由度減少熒光片段對蛋白互作的位阻效應，避免干擾蛋白功能。
2. 表達水平控制：低轉(zhuǎn)染量減少假陽性，平衡兩種蛋白表達效率。
3. 嚴格對照：設單獨片段對照，排除片段自發(fā)互補的可能，添加陰性和陽性對照。
4. 檢測條件：熒光信號通常在轉(zhuǎn)染后12-24小時開始出現(xiàn)，因熒光蛋白重構(gòu)需要折疊時間，建議在24-48小時內(nèi)完成成像，避免超過72小時因蛋白過飽和聚集產(chǎn)生假陽性，針對不同熒光蛋白設置合適激發(fā)/發(fā)射波長。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 直觀可視化：通過熒光顯微鏡（如共聚焦）實時觀測蛋白互作的亞細胞定位（如細胞膜、細胞核、細胞質(zhì)囊泡等），直接關聯(lián)互作事件與細胞功能區(qū)域。
2. 高特異性：僅當兩蛋白距離<10 nm時，熒光蛋白N/C端片段才能重構(gòu)成完整β-barrel構(gòu)并恢復熒光，降低假陽性。
3. 適用于弱/瞬時互作：熒光互補后形成穩(wěn)定發(fā)色團，可將短暫互作（如激酶-底物結(jié)合數(shù)秒）轉(zhuǎn)化為持續(xù)熒光信號，通過累計效應提升檢測靈敏度。
4. 多系統(tǒng)兼容：動物細胞、植物細胞及模式生物體內(nèi)均可應用，適用于原生質(zhì)體、組織切片及活體幼體等多種樣本類型。
5. 多色擴展應用：利用不同光譜的熒光蛋白（如GFP/YFP/CFP/RFP），通過光譜拆分技術實現(xiàn)2-3對互作的同時可視化分析。
▶局限：
1. 不可逆互補：熒光蛋白互補后形成共價或非共價穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，無法反映動態(tài)解離過程。
2. 假陽性風險：過表達可能導致蛋白非生理性聚集或片段自發(fā)互補（需單轉(zhuǎn)片段對照）。
3. 靈敏度限制：弱互作可能信號微弱，需搭配高靈敏度設備（如共聚焦顯微鏡）或信號放大系統(tǒng)（如mCherry標簽串聯(lián)）。
4. 蛋白構(gòu)像干擾：熒光蛋白片段插入可能影響目標蛋白的折疊或亞細胞定位。
5. 光穩(wěn)定性問題：常用熒光蛋白（GFP/YFP）在高強度光照下易發(fā)生光漂白（半衰期約 5-10 分鐘），需采用低光強成像+快速掃描或添加抗淬滅劑。
五、熒光素酶互補（LCI）
（一）技術簡介
熒光素酶互補實驗基于熒光素酶的特性來檢測蛋白質(zhì)的相互作用。原理是將熒光蟲熒光素酶（如Firefly luciferase）拆分成兩個無活性的N端和C端片段，再分別與待檢測的兩種目標蛋白融合表達。當目標蛋白發(fā)生相互作用時，兩個熒光素酶片段靠近重構(gòu)為有活性的酶，再加入熒光素底物可催化底物反應產(chǎn)生生物發(fā)光信號，通過檢測發(fā)光信號強度即可判斷蛋白間是否存在相互作用及作用強度。
1. 載體設計優(yōu)化：在目標蛋白與熒光片段之間添加柔性連接肽，通過增加空間自由度減少熒光片段對蛋白互作的位阻效應，避免干擾蛋白功能。
2. 表達水平控制：低轉(zhuǎn)染量減少假陽性，平衡兩種蛋白表達效率。
3. 嚴格對照：設單獨片段對照，排除片段自發(fā)互補的可能，添加陰性和陽性對照。
4. 檢測條件：熒光信號通常在轉(zhuǎn)染后12-24小時開始出現(xiàn)，因熒光蛋白重構(gòu)需要折疊時間，建議在24-48小時內(nèi)完成成像，避免超過72小時因蛋白過飽和聚集產(chǎn)生假陽性，針對不同熒光蛋白設置合適激發(fā)/發(fā)射波長。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 直觀可視化：通過熒光顯微鏡（如共聚焦）實時觀測蛋白互作的亞細胞定位（如細胞膜、細胞核、細胞質(zhì)囊泡等），直接關聯(lián)互作事件與細胞功能區(qū)域。
2. 高特異性：僅當兩蛋白距離<10 nm時，熒光蛋白N/C端片段才能重構(gòu)成完整β-barrel構(gòu)并恢復熒光，降低假陽性。
3. 適用于弱/瞬時互作：熒光互補后形成穩(wěn)定發(fā)色團，可將短暫互作（如激酶-底物結(jié)合數(shù)秒）轉(zhuǎn)化為持續(xù)熒光信號，通過累計效應提升檢測靈敏度。
4. 多系統(tǒng)兼容：動物細胞、植物細胞及模式生物體內(nèi)均可應用，適用于原生質(zhì)體、組織切片及活體幼體等多種樣本類型。
5. 多色擴展應用：利用不同光譜的熒光蛋白（如GFP/YFP/CFP/RFP），通過光譜拆分技術實現(xiàn)2-3對互作的同時可視化分析。
▶局限：
1. 不可逆互補：熒光蛋白互補后形成共價或非共價穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，無法反映動態(tài)解離過程。
2. 假陽性風險：過表達可能導致蛋白非生理性聚集或片段自發(fā)互補（需單轉(zhuǎn)片段對照）。
3. 靈敏度限制：弱互作可能信號微弱，需搭配高靈敏度設備（如共聚焦顯微鏡）或信號放大系統(tǒng)（如mCherry標簽串聯(lián)）。
4. 蛋白構(gòu)像干擾：熒光蛋白片段插入可能影響目標蛋白的折疊或亞細胞定位。
5. 光穩(wěn)定性問題：常用熒光蛋白（GFP/YFP）在高強度光照下易發(fā)生光漂白（半衰期約 5-10 分鐘），需采用低光強成像+快速掃描或添加抗淬滅劑。
五、熒光素酶互補（LCI）
（一）技術簡介
熒光素酶互補實驗基于熒光素酶的特性來檢測蛋白質(zhì)的相互作用。原理是將熒光蟲熒光素酶（如Firefly luciferase）拆分成兩個無活性的N端和C端片段，再分別與待檢測的兩種目標蛋白融合表達。當目標蛋白發(fā)生相互作用時，兩個熒光素酶片段靠近重構(gòu)為有活性的酶，再加入熒光素底物可催化底物反應產(chǎn)生生物發(fā)光信號，通過檢測發(fā)光信號強度即可判斷蛋白間是否存在相互作用及作用強度。
（二）實驗注意事項
1. 載體設計優(yōu)化：在目標蛋白與熒光素酶片段之間添加柔性連接肽，通過增加空間自由度減少位阻效應，避免干擾蛋白功能。
2. 表達水平控制：低轉(zhuǎn)染量減少假陽性，平衡兩種蛋白表達效率。
3. 嚴格對照：設單獨片段對照，排除片段自發(fā)互補的可能，添加陰性和陽性對照。
4. 檢測條件：熒光信號通常在轉(zhuǎn)染后12-24小時開始出現(xiàn)，因熒光蛋白重構(gòu)需要折疊時間，建議在24-48小時內(nèi)完成成像，避免超過72小時因蛋白過飽和聚集產(chǎn)生假陽性。發(fā)光信號半衰期約30分鐘，需在添加底物后5-10分鐘內(nèi)完成檢測，并設置復孔（n≥3）降低誤差。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 高靈敏度：可檢測弱或瞬時互作（如NanoLuc信號強度比Firefly高100倍）。
2. 定量性強：化學發(fā)光信號線性達7-8個數(shù)量級，適用于定量分析互作親和力及藥物對互作的抑制/激活效應）。
3. 活細胞/體內(nèi)應用：適用于植物（如煙草葉片瞬時表達） 和動物模型（如小鼠腫瘤細胞活體成像）。
4. 無自發(fā)熒光干擾：生物發(fā)光無需激發(fā)光，避免細胞自發(fā)熒光（如葉綠素、膠原蛋白）和熒光蛋白的光漂白問題。
▶局限：
1. 不可逆互補：熒光素酶片段互補后形成穩(wěn)定的催化構(gòu)象，解離半衰期>24小時，無法反映生理條件下的動態(tài)解離過程（如激酶-底物的互作）。
2. 過表達假陽性：高濃度蛋白可能導致非生理性聚集（需控制表達量并驗證內(nèi)源互作，設置單轉(zhuǎn)片段對照）。
3. 蛋白構(gòu)像干擾：熒光素酶片段融合可能影響目標蛋白的折疊或亞細胞定位。
4. 光穩(wěn)定性問題：發(fā)光信號在添加底物后30分鐘內(nèi)衰減50%（如螢火蟲熒光素酶），需在5-15分鐘內(nèi)完成檢測，不適合長時間互作追蹤。
六、表面等離子共振（SPR）
（一）技術簡介
SPR是一種基于光學原理的無標記生物分子相互作用分析技術，核心原理是：
當一束偏振光以臨界角入射到玻璃棱鏡與金屬膜（通常為金膜）的界面時，會發(fā)生全反射并產(chǎn)生消逝波。若金屬膜表面固定的靶分子（如受體、抗體）與溶液中的分析物（如配體、抗原）發(fā)生結(jié)合，會引起金屬膜表面的折射率變化，進而導致反射光的共振角偏移。通過監(jiān)測共振角偏移量（ΔRU，響應單位），可實時定量分析分子間的結(jié)合/解離動力學過程及親和力強弱。
1.核心組件
1. 載體設計優(yōu)化：在目標蛋白與熒光素酶片段之間添加柔性連接肽，通過增加空間自由度減少位阻效應，避免干擾蛋白功能。
2. 表達水平控制：低轉(zhuǎn)染量減少假陽性，平衡兩種蛋白表達效率。
3. 嚴格對照：設單獨片段對照，排除片段自發(fā)互補的可能，添加陰性和陽性對照。
4. 檢測條件：熒光信號通常在轉(zhuǎn)染后12-24小時開始出現(xiàn)，因熒光蛋白重構(gòu)需要折疊時間，建議在24-48小時內(nèi)完成成像，避免超過72小時因蛋白過飽和聚集產(chǎn)生假陽性。發(fā)光信號半衰期約30分鐘，需在添加底物后5-10分鐘內(nèi)完成檢測，并設置復孔（n≥3）降低誤差。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 高靈敏度：可檢測弱或瞬時互作（如NanoLuc信號強度比Firefly高100倍）。
2. 定量性強：化學發(fā)光信號線性達7-8個數(shù)量級，適用于定量分析互作親和力及藥物對互作的抑制/激活效應）。
3. 活細胞/體內(nèi)應用：適用于植物（如煙草葉片瞬時表達） 和動物模型（如小鼠腫瘤細胞活體成像）。
4. 無自發(fā)熒光干擾：生物發(fā)光無需激發(fā)光，避免細胞自發(fā)熒光（如葉綠素、膠原蛋白）和熒光蛋白的光漂白問題。
▶局限：
1. 不可逆互補：熒光素酶片段互補后形成穩(wěn)定的催化構(gòu)象，解離半衰期>24小時，無法反映生理條件下的動態(tài)解離過程（如激酶-底物的互作）。
2. 過表達假陽性：高濃度蛋白可能導致非生理性聚集（需控制表達量并驗證內(nèi)源互作，設置單轉(zhuǎn)片段對照）。
3. 蛋白構(gòu)像干擾：熒光素酶片段融合可能影響目標蛋白的折疊或亞細胞定位。
4. 光穩(wěn)定性問題：發(fā)光信號在添加底物后30分鐘內(nèi)衰減50%（如螢火蟲熒光素酶），需在5-15分鐘內(nèi)完成檢測，不適合長時間互作追蹤。
六、表面等離子共振（SPR）
（一）技術簡介
SPR是一種基于光學原理的無標記生物分子相互作用分析技術，核心原理是：
當一束偏振光以臨界角入射到玻璃棱鏡與金屬膜（通常為金膜）的界面時，會發(fā)生全反射并產(chǎn)生消逝波。若金屬膜表面固定的靶分子（如受體、抗體）與溶液中的分析物（如配體、抗原）發(fā)生結(jié)合，會引起金屬膜表面的折射率變化，進而導致反射光的共振角偏移。通過監(jiān)測共振角偏移量（ΔRU，響應單位），可實時定量分析分子間的結(jié)合/解離動力學過程及親和力強弱。
1.核心組件
2. 關鍵技術參數(shù)
響應單位（RU）：1RU≈1ng/mm² 的分子質(zhì)量變化，反映結(jié)合分子的量。
動力學參數(shù)：
結(jié)合相（Association）：分析物與靶分子結(jié)合的速率（kon，單位：M⁻¹・s⁻¹）。
解離相（Dissociation）：結(jié)合復合物解離的速率（koff，單位：s⁻¹）。
平衡解離常數(shù)（KD）：反映親和力，KD越小，親和力越強（如KD<10−9M為高親和力）。
檢測范圍：可檢測低至nM級的親和力（如瞬時互作）和快至秒級的動力學過程。
（二）實驗注意事項
1. 在固定配體時，要保證配體的活性和固定的穩(wěn)定性，避免配體在實驗過程中脫落或失活。同時，要優(yōu)化樣品的濃度和流速，以獲得最佳的信號響應 。
2. 由于SPR信號容易受到外界環(huán)境因素的影響，如溫度、溶液中的雜質(zhì)等，所以實驗過程中要保持環(huán)境的穩(wěn)定，使用高質(zhì)量的緩沖液和純凈的樣品。
3. 在數(shù)據(jù)分析時，要選擇合適的擬合模型，根據(jù)實驗目的和數(shù)據(jù)特點進行參數(shù)計算，避免因模型選擇不當導致結(jié)果偏差 。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 無標記：無需熒光/同位素標記，保留分子天然構(gòu)象。
2. 實時動態(tài)：直接監(jiān)測結(jié)合-解離全過程，提供動力學參數(shù)。
3. 高靈敏度：可檢測低至pg級的分子結(jié)合（如單克隆抗體）。
4. 高通量：搭配自動進樣器可實現(xiàn)批量樣品分析。
▶局限：
1. 需純化分子：靶蛋白和分析物需高度純化（不適用于細胞裂解液等復雜體系）。
2. 儀器成本高：商用SPR設備（如Biacore系列）價格通常在百萬級別。
3. 固定效應：靶蛋白固定可能影響其構(gòu)象，導致假陰性 / 假陽性結(jié)果。
響應單位（RU）：1RU≈1ng/mm² 的分子質(zhì)量變化，反映結(jié)合分子的量。
動力學參數(shù)：
結(jié)合相（Association）：分析物與靶分子結(jié)合的速率（kon，單位：M⁻¹・s⁻¹）。
解離相（Dissociation）：結(jié)合復合物解離的速率（koff，單位：s⁻¹）。
平衡解離常數(shù)（KD）：反映親和力，KD越小，親和力越強（如KD<10−9M為高親和力）。
檢測范圍：可檢測低至nM級的親和力（如瞬時互作）和快至秒級的動力學過程。
（二）實驗注意事項
1. 在固定配體時，要保證配體的活性和固定的穩(wěn)定性，避免配體在實驗過程中脫落或失活。同時，要優(yōu)化樣品的濃度和流速，以獲得最佳的信號響應 。
2. 由于SPR信號容易受到外界環(huán)境因素的影響，如溫度、溶液中的雜質(zhì)等，所以實驗過程中要保持環(huán)境的穩(wěn)定，使用高質(zhì)量的緩沖液和純凈的樣品。
3. 在數(shù)據(jù)分析時，要選擇合適的擬合模型，根據(jù)實驗目的和數(shù)據(jù)特點進行參數(shù)計算，避免因模型選擇不當導致結(jié)果偏差 。
（三）優(yōu)勢與局限
▶優(yōu)勢：
1. 無標記：無需熒光/同位素標記，保留分子天然構(gòu)象。
2. 實時動態(tài)：直接監(jiān)測結(jié)合-解離全過程，提供動力學參數(shù)。
3. 高靈敏度：可檢測低至pg級的分子結(jié)合（如單克隆抗體）。
4. 高通量：搭配自動進樣器可實現(xiàn)批量樣品分析。
▶局限：
1. 需純化分子：靶蛋白和分析物需高度純化（不適用于細胞裂解液等復雜體系）。
2. 儀器成本高：商用SPR設備（如Biacore系列）價格通常在百萬級別。
3. 固定效應：靶蛋白固定可能影響其構(gòu)象，導致假陰性 / 假陽性結(jié)果。
蛋白互作不同方法的比較
上述介紹了6種常用的蛋白質(zhì)互作研究方法。不同技術的檢測原理、實驗條件及靈敏度存在差異，可能導致結(jié)果不一致。建議根據(jù)研究目標（如篩選、驗證、定量或定位）和樣品特性（如蛋白亞細胞定位、互作強弱），選擇單一方法或聯(lián)合多種技術交叉驗證。
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