抗犬腺病毒 1/2 型單克隆抗體的研究背景與制備流程
一、犬腺病毒與單克隆抗體的研究背景
二、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的制備流程
1. 抗原制備
三、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的特異性與應用
1. 特異性驗證
四、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的應用案例
1. CAV-1/2 分型檢測 ELISA
五、局限性與發(fā)展方向
1. 局限性
犬腺病毒（Canine Adenovirus, CAV）分為 CAV-1 和 CAV-2 兩種血清型：
- CAV-1：可引起犬傳染性肝炎（ICH），導致肝臟、腎臟等器官損傷；
- CAV-2：主要引起犬傳染性喉氣管炎（犬窩咳），常與其他呼吸道病毒（如犬副流感病毒、犬瘟熱病毒）協(xié)同感染。
單克隆抗體（mAb）因其高特異性和均一性，在 CAV-1/2 的檢測、分型及致病機制研究中具有重要價值。
二、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的制備流程
1. 抗原制備
- CAV-1/2 抗原選擇：
- 病毒顆�？乖�：通過細胞培養(yǎng)（如犬腎細胞系 MDCK、A72 細胞）增殖病毒，經滅活、純化后獲得全病毒抗原。
- 特異性蛋白抗原：選擇 CAV-1/2 的結構蛋白（如六鄰體蛋白 Hexon、纖維蛋白 Fiber）或非結構蛋白，通過基因工程技術（如大腸桿菌 / 桿狀病毒表達系統(tǒng)）制備重組抗原。
- 抗原純化：采用密度梯度離心（如 CsCl 離心）或層析法去除宿主細胞蛋白，確保抗原純度。
- 實驗動物：常用 Balb/c 小鼠或大鼠，通過腹腔注射抗原（輔以弗氏佐劑），免疫 3-4 次（間隔 2-3 周），末次免疫后 3-5 天取脾臟分離脾細胞。
- 免疫策略：若需制備同時識別 CAV-1/2 的交叉反應抗體，可使用混合抗原免疫；若需分型特異性抗體，需分別使用 CAV-1 和 CAV-2 抗原免疫。
- 細胞融合：脾細胞與骨髓瘤細胞（如 SP2/0、NS0）在 PEG 或電融合條件下融合，通過 HAT 培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞。
- 篩選方法：
- 間接 ELISA：以 CAV-1/2 抗原包被板，篩選能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株。
- 中和試驗（NT）：檢測抗體對病毒感染細胞的中和能力，篩選具有中和活性的單克隆抗體。
- 免疫熒光（IFA）：驗證抗體與病毒感染細胞的結合特異性，排除非特異性反應。
- 體內擴增：雜交瘤細胞注射至小鼠腹腔，收集腹水，通過 Protein A/G 親和層析或硫酸銨沉淀法純化抗體。
- 體外擴增：無血清培養(yǎng)基大規(guī)模培養(yǎng)，結合層析技術純化，適用于工業(yè)化生產。
三、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的特異性與應用
1. 特異性驗證
- 型間交叉反應：通過 ELISA/Western blot 檢測抗體與 CAV-1 和 CAV-2 的結合活性，區(qū)分：
- 型特異性抗體：僅識別 CAV-1 或 CAV-2 單一型別；
- 交叉反應抗體：同時識別 CAV-1 和 CAV-2（如針對保守抗原表位）。
- 中和活性驗證：通過病毒中和試驗確定抗體是否能阻斷病毒與宿主細胞受體的結合，評估其潛在治療價值。
- 病毒檢測與分型：
- ELISA / 膠體金試紙條：作為捕獲抗體或檢測抗體，用于犬血清、分泌物（如呼吸道拭子）中的 CAV-1/2 抗原檢測。例如，CAV-2 檢測試紙條可輔助診斷犬窩咳。
- 免疫熒光（IFA）/ 免疫組化（IHC）：定位病毒在感染組織中的分布（如 CAV-1 感染的肝臟細胞），輔助病理診斷。
- 病毒中和機制研究：通過單克隆抗體識別的抗原表位，分析 CAV-1/2 的入侵機制（如纖維蛋白與宿主細胞受體的結合位點）。
- 治療性抗體開發(fā)：針對 CAV-1 引起的重癥肝炎，具有中和活性的單克隆抗體可作為被動免疫制劑，與抗病毒藥物聯(lián)用提高療效。
- 疫苗研發(fā)工具：篩選能識別病毒保護性抗原表位的單克隆抗體，指導亞單位疫苗或基因工程疫苗的設計。
四、抗 CAV-1/2 單克隆抗體的應用案例
1. CAV-1/2 分型檢測 ELISA
- 原理：
- 包被板分別固定 CAV-1 和 CAV-2 特異性抗原；
- 待檢樣本中的抗體與抗原結合后，通過酶標二抗顯色，根據 OD 值判斷樣本中 CAV-1 或 CAV-2 抗體的類型及滴度。
- 優(yōu)勢：相比傳統(tǒng)血清學方法，單克隆抗體 ELISA 具有更高的特異性和重復性，可區(qū)分兩種血清型的感染。
- 實驗模型：建立 CAV-2 感染的犬類模型，注射特異性中和單克隆抗體，觀察其對呼吸道癥狀（如咳嗽、流涕）的緩解效果及病毒載量的下降趨勢。
- 應用價值：對于免疫功能低下的幼犬，單克隆抗體可作為緊急干預手段，降低繼發(fā)細菌感染的風險。
五、局限性與發(fā)展方向
1. 局限性
- 病毒抗原變異：CAV-1/2 的結構蛋白可能因基因突變導致抗原表位改變，影響單克隆抗體的結合效率。
- 生產成本與規(guī)模化：傳統(tǒng)雜交瘤技術制備單克隆抗體周期長、成本高，需結合重組抗體技術（如噬菌體展示、酵母展示）優(yōu)化生產流程。
- 雙特異性抗體：設計同時識別 CAV-1 和 CAV-2 保守表位的雙特異性抗體，提高檢測或治療的廣譜性。
- 納米抗體（VHH）開發(fā)：從駱駝科動物中篩選抗 CAV-1/2 的納米抗體，其分子量小、穩(wěn)定性高，更適合作為診斷探針或口服治療劑。
- 聯(lián)合檢測體系：將抗 CAV-1/2 單克隆抗體與抗犬瘟熱、犬細小病毒等抗體組合，開發(fā)多聯(lián)檢測試劑盒，滿足臨床快速篩查需求。
