犬血紅蛋白單克隆抗體的詳細(xì)制備流程

一、制備背景與意義
犬血紅蛋白（Hemoglobin, Hb）是犬紅細(xì)胞中負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧氣的關(guān)鍵蛋白，其單克隆抗體在犬類(lèi)疾病診斷（如貧血、溶血檢測(cè)）、血液學(xué)研究、藥物研發(fā)（如血紅蛋白降解機(jī)制研究）等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。制備高特異性的犬血紅蛋白單克隆抗體，需通過(guò)雜交瘤技術(shù)實(shí)現(xiàn)，以下為詳細(xì)制備流程。

二、制備關(guān)鍵流程
（一）抗原制備與純化
犬血紅蛋白的提取
樣本采集：從健康犬外周血中采集血液（需加入抗凝劑如 EDTA），離心（3000 rpm，10 分鐘）分離紅細(xì)胞。
紅細(xì)胞裂解：用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞 3 次，加入低滲裂解液（如 0.3% NaCl）使紅細(xì)胞破裂，釋放血紅蛋白。
純化方法：通過(guò)層析技術(shù)（如離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析）或電泳法（SDS-PAGE）純化血紅蛋白，去除雜蛋白，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度（純度需≥95%）。
抗原佐劑混合
將純化的犬血紅蛋白與佐劑（如弗氏完全佐劑 / 不完全佐劑）按 1:1 體積比混合，充分乳化，增強(qiáng)抗原免疫原性。

（二）動(dòng)物免疫
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇
選用 6-8 周齡 SPF 級(jí) Balb/c 小鼠（免疫原性好、雜交瘤融合效率高），每組 3-5 只。

免疫方案
初次免疫：小鼠背部多點(diǎn)皮下注射乳化抗原（50-100 μg / 只），使用弗氏完全佐劑。
加強(qiáng)免疫：每隔 2-3 周注射一次，共 3-4 次，改用弗氏不完全佐劑，劑量同初次。
免疫效果檢測(cè)：末次免疫后 7-10 天，采集小鼠尾尖血，用 ELISA 法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，選擇效價(jià)≥1:10000 的小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
（三）脾細(xì)胞獲取與細(xì)胞融合
脾細(xì)胞制備
對(duì)抗體效價(jià)高的小鼠，末次免疫后 3 天，頸椎脫臼處死，無(wú)菌取出脾臟，研磨過(guò)篩，制備單細(xì)胞懸液，用 PBS 洗滌 2 次，計(jì)數(shù)細(xì)胞。
骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備
選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞（如 SP2/0 或 NS0 細(xì)胞），用完全培養(yǎng)基（含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640）培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，與脾細(xì)胞按 1:3-1:5 比例混合。
細(xì)胞融合

在 50% 聚乙二醇（PEG 1500-2000）作用下，37℃孵育 1-2 分鐘誘導(dǎo)融合，隨后加入預(yù)熱的不完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，離心收集細(xì)胞，用 HAT 選擇性培養(yǎng)基重懸，接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔約 2×10^5 個(gè)細(xì)胞）。
（四）雜交瘤細(xì)胞篩選與克隆化
HAT 培養(yǎng)基篩選

培養(yǎng) 4-5 天后，未融合的脾細(xì)胞（不能長(zhǎng)期存活）和骨髓瘤細(xì)胞（缺乏 HGPRT 或 TK 酶，無(wú)法在 HAT 培養(yǎng)基中增殖）死亡，僅雜交瘤細(xì)胞存活。
ELISA 法篩選陽(yáng)性克隆
培養(yǎng) 7-10 天后，取培養(yǎng)上清，以純化的犬血紅蛋白為包被抗原，用 ELISA 法篩選能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞孔（OD 值≥陰性對(duì)照 2.1 倍為陽(yáng)性）。
有限稀釋法克隆化

將陽(yáng)性孔細(xì)胞用有限稀釋法（調(diào)整細(xì)胞濃度至 0.5-1 個(gè)細(xì)胞 / 孔）接種于 96 孔板，培養(yǎng)后再次用 ELISA 篩選單克隆細(xì)胞，重復(fù) 3 次，確保單克隆細(xì)胞株的穩(wěn)定性。
（五）單克隆抗體的生產(chǎn)與純化
體內(nèi)誘生法
向 Balb/c 小鼠腹腔注射石蠟油（1 周前）預(yù)處理，隨后接種雜交瘤細(xì)胞（1×10^6 個(gè) / 只），7-10 天后收集腹水，腹水抗體濃度高（可達(dá) 1-10 mg/mL），適用于大量制備。
體外培養(yǎng)法
將雜交瘤細(xì)胞接種于血清 - free 培養(yǎng)基或懸浮培養(yǎng)體系，收集培養(yǎng)上清，抗體濃度較低（約 50-200 μg/mL），但純度較高，適用于小規(guī)模制備。
抗體純化
腹水純化：先用硫酸銨沉淀法去除雜蛋白，再通過(guò) Protein A/G 親和層析、離子交換層析進(jìn)一步純化，獲得高純度單克隆抗體。
上清純化：直接通過(guò)親和層析或超濾法濃縮純化。
（六）抗體鑒定
效價(jià)測(cè)定
ELISA 法檢測(cè)抗體滴度，腹水抗體效價(jià)應(yīng)≥1:10^5，上清效價(jià)≥1:10^3。
特異性鑒定
Western blot：檢測(cè)抗體與犬血紅蛋白的特異性結(jié)合，同時(shí)驗(yàn)證是否與其他犬類(lèi)蛋白（如血清白蛋白、其他紅細(xì)胞抗原）交叉反應(yīng)。
免疫熒光或免疫組化：驗(yàn)證抗體對(duì)犬紅細(xì)胞中血紅蛋白的定位特異性。
亞型鑒定
用小鼠單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒，確定抗體的 Ig 亞型（如 IgG1、IgG2a 等），便于后續(xù)應(yīng)用選擇。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
抗原純度：雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致非特異性抗體產(chǎn)生，純化后的抗原需通過(guò) SDS-PAGE 和 Western blot 驗(yàn)證。
免疫周期：過(guò)度免疫可能導(dǎo)致小鼠免疫耐受，免疫間隔和次數(shù)需嚴(yán)格控制。
細(xì)胞融合效率：PEG 作用時(shí)間和溫度需精確控制（37℃，1-2 分鐘），避免細(xì)胞損傷。
無(wú)菌操作：雜交瘤培養(yǎng)過(guò)程中需嚴(yán)格無(wú)菌，避免細(xì)菌或支原體污染。
動(dòng)物倫理：實(shí)驗(yàn)需符合動(dòng)物保護(hù)倫理規(guī)范，使用 SPF 級(jí)動(dòng)物并減少痛苦。

四、應(yīng)用方向
診斷試劑開(kāi)發(fā)：用于犬貧血、溶血性疾病（如免疫介導(dǎo)性溶血性貧血）的快速檢測(cè)試劑盒。
基礎(chǔ)研究：研究犬血紅蛋白結(jié)構(gòu)與功能、紅細(xì)胞生成機(jī)制或寄生蟲(chóng)（如巴貝斯蟲(chóng)）與血紅蛋白的相互作用。
治療研究：作為靶向載體，結(jié)合藥物用于犬血液系統(tǒng)疾病的靶向治療（如實(shí)驗(yàn)性研究）。