使用CLARIOstar Plus酶標(biāo)儀測(cè)定植物樣品和食品中的抗氧化能力

氧自由基吸收能力（ORAC）檢測(cè)是一種實(shí)驗(yàn)室測(cè)試，用于測(cè)量食品單位質(zhì)量的抗氧化能力。它通常與TEAC、FRAP、TRAP、Folin、DPPH和CUPRAC等測(cè)定法結(jié)合使用。這些測(cè)試通常用于評(píng)估食品中和自由基的功效。

自由基是在正常代謝過程中（如進(jìn)食和呼吸）以及外部因素（如污染和吸煙）中產(chǎn)生的。當(dāng)自由基過度生成或正常代謝過程無法有效清除自由基時(shí)，可能導(dǎo)致多種疾�。ㄈ缣悄虿�、腎缺血、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥）以及加速衰老。攝入抗氧化能力較強(qiáng)的食品可以幫助降低體內(nèi)自由基濃度。盡管目前尚無充分?jǐn)?shù)據(jù)證明食品的抗氧化能力與健康效果之間存在直接相關(guān)性，但人們普遍認(rèn)為，富含抗氧化物質(zhì)（如水果和蔬菜）的飲食對(duì)健康有益。因此，ORAC 檢測(cè)作為評(píng)估食品抗氧化能力的重要研究工具仍具有很高的價(jià)值。

在 ORAC 檢測(cè)中，熒光素與 AAPH 發(fā)生反應(yīng)（見圖 1）。隨著反應(yīng)進(jìn)行，熒光強(qiáng)度逐漸下降。如果樣品不具有抗氧化能力（僅含緩沖液），熒光會(huì)迅速減弱，導(dǎo)致熒光曲線下的面積（AUC）變小。僅含緩沖液的樣品被用作空白對(duì)照。

圖1：AAPH的熱分解會(huì)生成自由基，與熒光素發(fā)生反應(yīng)，生成無熒光產(chǎn)物。

  
在本研究中，ORAC檢測(cè)法用于測(cè)試葉提取物、植物飲料、果汁和混合漿果的抗氧化能力。為了對(duì)未知樣品的抗氧化能力進(jìn)行分類，測(cè)得的 AUC 數(shù)據(jù)將與具有良好表征的抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。本研究中，使用了Trolox（維生素E等效物）作為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑。與空白對(duì)照一起，在黑色96孔板中繪制了Trolox（800 µM - 25 µM）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，除了空白對(duì)照和Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線外，還制備了食物樣品的10倍稀釋系列，并在與Trolox標(biāo)準(zhǔn)和空白對(duì)照相同的條件下與熒光素和AAPH反應(yīng)。通過在CLARIOstar Plus 中測(cè)量熒光素在37°C下的熒光強(qiáng)度，并使用動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)展技術(shù)每90秒測(cè)量一次，持續(xù)160分鐘，確定所有孔的AUC。根據(jù)食品樣品的濃度落在Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，計(jì)算得出對(duì)應(yīng)的抗氧化能力值，單位為µM TE（Trolox當(dāng)量）/100克樣品。

Trolox標(biāo)準(zhǔn)抗氧化能力

從空白（紅色）和Trolox標(biāo)準(zhǔn)（圖2）的原始數(shù)據(jù)可以看出，熒光衰減隨著Trolox濃度的增加而降低。

圖2：在不同的Trolox濃度下，AAPH對(duì)熒光素的作用的衰減曲線（紅色）。AUC（總和）與所用Trolox的濃度呈正相關(guān)。

  
通過對(duì)減去空白對(duì)照后的數(shù)據(jù)計(jì)算，獲得所有Trolox標(biāo)準(zhǔn)的AUC值�；�于這些AUC數(shù)據(jù)，生成了以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)的抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3）。

圖 3：Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線：R² = 0.99900

 
天然樣品的抗氧化能力

使用Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所有葉提取物、植物飲料、果汁和混合漿果樣品稀釋液的AUC數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Trolox等效物（TE）。對(duì)于這四種不同的產(chǎn)品，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的稀釋液來計(jì)算樣品的抗氧化能力。

示例：
- 對(duì)于葉提取物，測(cè)得其10倍稀釋后的抗氧化能力值落在Trolox曲線上。這相當(dāng)于98.136 µM TE/Kg（3次重復(fù)的平均值）的抗氧化能力，為了換算回原始粉末的抗氧化能力，需要將該值乘以10和5000，即4906.800 µM TE/Kg或490680 µM TE/100 g原始粉末。
- 對(duì)于混合漿果飲料，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其100倍稀釋后的樣品抗氧化能力值為213.2 µM TE/L（三次重復(fù)的平均值）。將此值乘以100，即可得出純凈飲料的數(shù)值，即21320微摩爾TE/升飲料或2132微摩爾TE/100毫升飲料。

 
本研究中 4 種產(chǎn)品的最終抗氧化能力數(shù)值見表 1，這為比較這些食品中的抗氧化劑含量提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)。

結(jié)論

通過ORAC檢測(cè)法測(cè)定抗氧化能力需要大量數(shù)據(jù)計(jì)算才能得出最終值。在此過程中，MARS數(shù)據(jù)分析軟件展示了其極大的實(shí)用性。該軟件可以自動(dòng)執(zhí)行所有計(jì)算，只需單擊一下即可提供抗氧化能力的值，從而為多次測(cè)定節(jié)省大量時(shí)間。

數(shù)據(jù)還表明，CLARIOstar Plus（圖4）非常適合此類測(cè)定抗氧化能力的實(shí)驗(yàn)。該款讀數(shù)器配備有用于熒光檢測(cè)的專利線性可變?yōu)V波器（LVF）單色光柵，以及內(nèi)置注射器，可根據(jù)需要分配溶液、支持加熱和振蕩功能。它還具有自動(dòng)對(duì)焦和自動(dòng)增益功能，便于設(shè)置實(shí)驗(yàn)方案。

圖4：CLARIOstar Plus酶標(biāo)儀

 
點(diǎn)擊“閱讀原文”查看包含方法和酶標(biāo)儀設(shè)置的完整應(yīng)用說明。

  
References

1. Lopez-Alarcon C., Denicola A., Evaluating the antioxidant capacity of natural products: A review on chemical and cellular based assays. Analytica Chimica Acta, 2013, 763, 1-10.

2. Prior R.L., Oxygen radical absorbance capacity (ORAC): New horizons in relating dietary antioxidants/bioactives and health benefi ts: Journal of functional foods, 2015, 8, 797-810.

3. For the description of a Cellular Antioxidant Assay see; BMG LABTECH Application Note No. 280.

廣州進(jìn)科馳安科技有限公司
Bio-Gene Technology Ltd.
熱線：176 2009 3784
www.bio-gene.com.cn
marketing@bio-gene.com.cn
香港 北京 上海 廣州