針對(duì)原位耐藥膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腦靶向NIR-II聚合物光療納米平臺(tái)

本文要點(diǎn)：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤因其高侵襲性和高頻耐藥性成為最常見(jiàn)且最具破壞性的腦腫瘤。基于聚合物發(fā)光劑的近紅外二區(qū)成像引導(dǎo)光療法雖為耐藥性膠質(zhì)瘤提供了有前景的治療方案，但難以實(shí)現(xiàn)光能利用率最大化。本研究設(shè)計(jì)了一系列半導(dǎo)體聚合物以增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的可視化與消融能力。通過(guò)精妙調(diào)控吩噻嗪和噻吩基團(tuán)的側(cè)鏈或取代基，研究者獲得了兼具優(yōu)質(zhì)熒光性能、良好溶解性、卓越光熱轉(zhuǎn)換能力及平衡活性氧生成效率的近紅外二區(qū)聚合物發(fā)光劑。最優(yōu)聚合物采用支化烷基鏈與四苯乙烯懸垂基團(tuán)，調(diào)控輻射能量耗散通道與非輻射能量耗散通道間的平衡。高靈敏度近紅外二區(qū)成像技術(shù)成功監(jiān)測(cè)了載脂蛋白E修飾聚合物納米粒的血腦屏障穿透及膠質(zhì)瘤細(xì)胞靶向過(guò)程。近紅外照射觸發(fā)并最大化了光子在原位耐藥性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的光動(dòng)力/光熱協(xié)同治療中的利用率。

圖1. 腦靶向載脂蛋白E（ApoE）修飾聚合物納米粒的設(shè)計(jì)、制備及其對(duì)荷原位耐藥膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠的協(xié)同光熱和光動(dòng)力治療

本研究通過(guò)側(cè)鏈工程開(kāi)發(fā)了一種基于吩噻嗪(PTZ)的、具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)特性的近紅外二區(qū)半導(dǎo)體聚合物診療系統(tǒng)，其中PTZ單元作為電子供體核心和振動(dòng)單元促進(jìn)聚合物調(diào)控(圖1)。通過(guò)改變噻吩橋上的空間位阻側(cè)鏈和PTZ核的取代基，系統(tǒng)研究了側(cè)鏈片段對(duì)聚合物溶解度和光物理性能的影響。具有典型AIE特性和優(yōu)異溶劑溶解度的最優(yōu)聚合物(P3)可自組裝為水分散納米顆粒(P3 NPs)，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)高質(zhì)量近紅外二區(qū)熒光成像。該納米顆粒同時(shí)表現(xiàn)出卓越的光穩(wěn)定性、高光熱轉(zhuǎn)換效率及808nm激光激發(fā)的良好活性氧產(chǎn)出。進(jìn)一步整合腦靶向載脂蛋白E(ApoE)獲得的ApoE-P3 NPs，顯示出顯著的血腦屏障穿透能力和對(duì)耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增強(qiáng)靶向性。出色的近紅外二區(qū)熒光成像導(dǎo)航的協(xié)同光動(dòng)力/光熱治療，有效消融了原位耐藥膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型的腫瘤，將生存期從磷酸鹽緩沖液(PBS)組的17天顯著延長(zhǎng)至45天。這種精巧的分子設(shè)計(jì)和成功的近紅外二區(qū)診療策略，為腦疾病和其他耐藥腫瘤建立了強(qiáng)大的診療范式。

三種具有相同半導(dǎo)體骨架但不同側(cè)鏈的半導(dǎo)體聚合物（P1-P3，圖2a）分別通過(guò)單體PTZ和T-BBTD-T之間的Pd催化Stille偶聯(lián)縮合合成。采用M062X/6-31G(d,p)方法進(jìn)行了密度泛函理論(DFT)計(jì)算，評(píng)估簡(jiǎn)化模型P1-P3重復(fù)單元的電子分布與幾何構(gòu)型。結(jié)果顯示吩噻嗪?jiǎn)卧�呈蝶形非平面結(jié)構(gòu)，P1、P2、P3中兩苯環(huán)二面角(θ)分別為137.74°、144.17°和149.86°（圖2b）。BBTD核心與噻吩間隔基的二面角范圍為38.43°至52.75°（圖2c），表明其骨架扭曲特征，該構(gòu)型有利于阻斷分子間相互作用。如圖2d,e所示，P1-P3的最低未占分子軌道(LUMO)電子主要離域于BBTD核心，而最高占據(jù)分子軌道(HOMO)則分布于整個(gè)共軛主鏈，揭示了強(qiáng)給體-受體(D-A)結(jié)構(gòu)中的典型電荷分離特性。P1、P2、P3的能隙估值分別為3.14、3.26和3.23 eV。三者最大吸收峰分別位于804 nm、804 nm和712 nm，對(duì)應(yīng)質(zhì)量消光系數(shù)為17.7、18.4和12.7 L g⁻¹ cm⁻¹，表明其在近紅外窗口具有強(qiáng)吸收能力（圖2f）。此外，P1-P3的光致發(fā)光(PL)光譜在900-1500 nm呈現(xiàn)寬發(fā)射帶（圖2g）。值得注意的是，P1和P2在聚集態(tài)下隨不良溶劑比例增加顯現(xiàn)熒光淬滅，呈現(xiàn)典型聚集導(dǎo)致淬滅(ACQ)特性。而具有大位阻螺旋槳狀四苯乙烯(TPE)基團(tuán)的P3，在密堆積時(shí)有效抑制了鏈內(nèi)/鏈間π–π堆積，使聚集態(tài)熒光強(qiáng)度提升2.2倍（圖2h），展現(xiàn)優(yōu)異聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)特性，為高靈敏度近紅外二區(qū)熒光成像應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖3. P3 NPs的表征

得益于優(yōu)異聚集誘導(dǎo)發(fā)光性能，P3成為體外體內(nèi)應(yīng)用的理想候選材料。自組裝P3納米顆粒平均粒徑為169.0納米（圖3a），在磷酸鹽緩沖液、純水和胰蛋白酶溶液中保持5天穩(wěn)定分散（圖3b）。其最大吸收峰與發(fā)射峰分別位于740納米和1016納米，發(fā)射光譜延伸至1400納米（圖3c）。該特性使P3納米顆粒在不同帶通濾光片下仍呈現(xiàn)明亮的濃度依賴(lài)性近紅外二區(qū)熒光（圖3d）。此外，P3納米顆�？汕逦�勾勒全身血管系統(tǒng)（尤其是腹部及后肢血管），成像信號(hào)顯著優(yōu)于吲哚菁綠（ICG），信噪比明顯提升（圖3e）。納米顆粒在腦腫瘤區(qū)域的實(shí)時(shí)分布與積累過(guò)程被清晰呈現(xiàn)（圖3f），證實(shí)P3納米粒子具備高質(zhì)量近紅外二區(qū)成像能力，在原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤監(jiān)測(cè)中展現(xiàn)巨大潛力。光熱性能方面，P3納米顆粒吸收的光能可高效轉(zhuǎn)化為熱能，其溫升效應(yīng)呈輻照時(shí)間與濃度雙重依賴(lài)性（圖3g）。200μM濃度樣品經(jīng)360秒輻照后溫升達(dá)35.1°C，遠(yuǎn)超純水6.9°C的溫升幅度。熱成像圖直觀(guān)顯示含P3液滴的溫度顯著升高（圖3h）。更重要的是，P3納米顆粒具備卓越抗光漂白能力，808納米激光持續(xù)照射30分鐘后吸光度變化可忽略（圖3i），P3納米顆粒光熱轉(zhuǎn)換效率（η）達(dá)20.6%。電子自旋共振譜捕獲到單線(xiàn)態(tài)氧、羥基自由基和超氧自由基的強(qiáng)特征信號(hào)（圖3j-l），證實(shí)P3納米顆粒近紅外激光觸發(fā)多類(lèi)型活性氧生成能力。綜上，P3納米顆粒實(shí)現(xiàn)了近紅外光能的平衡利用，其分子設(shè)計(jì)合理，在近紅外二區(qū)成像引導(dǎo)的體內(nèi)光療領(lǐng)域前景廣闊。

圖4. ApoE-P3 NPs體外實(shí)驗(yàn)

隨后研究者評(píng)估了P3納米顆粒的體外診療效率。通過(guò)合成修飾型兩親性聚合物載體（DSPE-PEG-ApoE），將腦靶向肽（ApoE）整合至納米顆粒。Transwell實(shí)驗(yàn)定量表明，經(jīng)體外血腦屏障模型傳輸后，ApoE-P3納米顆粒的穿透效率較P3納米顆粒組提升3.1倍（圖4a）。共聚焦圖像證實(shí)ApoE-P3納米顆粒在3D腫瘤球體中的滲透性顯著增強(qiáng)（圖4b）。未輻照條件下，內(nèi)化的ApoE-P3納米顆粒對(duì)293T、HA1800、U87、U251-TR、LO2及Beas-2B細(xì)胞均無(wú)明顯毒性（圖4c）。此外在200 μM濃度下輻照9分鐘，ApoE-P3納米顆粒對(duì)U251-TR細(xì)胞的殺傷效率達(dá)86.5%，遠(yuǎn)優(yōu)于P3納米顆粒組（30.4%）和替莫唑胺組（13.9%）的微弱殺傷效果（圖4d,e）。這些結(jié)果證實(shí)ApoE-P3納米顆粒具備良好的生物相容性，并對(duì)耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有高效靶向治療能力。隨后通過(guò)DCFH-DA探針評(píng)估ApoE-P3納米顆粒的胞內(nèi)活性氧生成能力。共聚焦觀(guān)察顯示，ApoE-P3納米顆粒聯(lián)合輻照組兩種指示劑均呈現(xiàn)明亮熒光，而其他對(duì)照組熒光信號(hào)微弱，證實(shí)其在近紅外照射下能于U251-TR細(xì)胞內(nèi)高效產(chǎn)生活性氧（圖4f,g）。結(jié)晶紫染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ApoE-P3納米顆粒在光照條件下對(duì)U251-TR細(xì)胞的顯著殺傷作用（圖4h）。流式細(xì)胞分析表明：黑暗環(huán)境中單獨(dú)ApoE-P3納米顆粒僅誘導(dǎo)7.30%細(xì)胞死亡，而光照聯(lián)合組細(xì)胞死亡率達(dá)63.68%，顯著高于光照下P3納米顆粒組的6.23%（圖4i）。上述結(jié)果充分證明ApoE-P3納米顆粒具有優(yōu)異的靶向光療效率，可有效消融耐藥膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

圖5. ApoE-P3 NPs體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

接下來(lái)，按照?qǐng)D5a所示流程在荷U251-TR腫瘤小鼠體內(nèi)進(jìn)行診療研究。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，ApoE-P3納米顆粒與P3納米顆粒的體內(nèi)消除半衰期（t1/2,β）分別為2.88小時(shí)和0.52小時(shí)（圖5b）。如圖5c所示，P3納米顆粒組僅在注射后最初2小時(shí)內(nèi)觀(guān)察到微弱熒光信號(hào)；與之形成鮮明對(duì)比的是，注射ApoE-P3納米顆粒1小時(shí)后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤區(qū)域即呈現(xiàn)顯著熒光，24小時(shí)達(dá)到最大蓄積量，表明ApoE修飾有效促進(jìn)了ApoE-P3納米顆粒在原位U251-TR荷瘤小鼠體內(nèi)的血腦屏障穿透。后續(xù)生物分布結(jié)果顯示，兩種納米顆粒在主要臟器中分布相似，且在肝臟和脾臟中均有顯著蓄積（圖5d）。高效蓄積的ApoE-P3納米顆粒經(jīng)808納米輻照1分鐘后，誘導(dǎo)溫度急劇升高至44.1℃（圖5e），該值高于PBS組（38.1℃）和P3納米顆粒組（38.2℃），證實(shí)其具備高效的靶向光熱轉(zhuǎn)換能力。生存曲線(xiàn)分析顯示，ApoE-P3納米顆粒聯(lián)合808納米輻照組生存期延長(zhǎng)至45天，顯著優(yōu)于PBS組（17天）、單獨(dú)ApoE-P3納米顆粒組（20天）及P3納米顆粒聯(lián)合輻照組（24天），證實(shí)ApoE-P3納米顆粒對(duì)耐藥膠質(zhì)瘤具有優(yōu)異的光療效果（圖5f）。整個(gè)治療期間各組小鼠體重未見(jiàn)明顯波動(dòng)（圖5g），表明P3與ApoE-P3納米顆粒副作用輕微。H&E與TUNEL染色分析顯示，相較于其他三組，ApoE-P3納米顆粒聯(lián)合輻照組腫瘤切片呈現(xiàn)顯著縮小的瘤體體積和明顯的腫瘤細(xì)胞凋亡（圖5h,i）。綜上結(jié)果表明，ApoE-P3納米顆粒具備顯著生物相容性與安全性，對(duì)原位U251-TR膠質(zhì)瘤協(xié)同光動(dòng)力/光熱治療具有高效性。

參考文獻(xiàn)

Su X, Liu Y, Zhong Y, et al. A Brain-Targeting NIR-II Polymeric Phototheranostic Nanoplatform toward Orthotopic Drug-Resistant Glioblastoma[J]. Nano Letters, 2025, 25(9): 3445-3454.

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