雞胚原代細胞的培養(yǎng)步驟

PART1  實驗材料

①

試劑：Hank's液、含10%～20%血清的細胞培養(yǎng)液、碘酊棉、酒精棉、0.25%胰酶。

②

器材：超凈工作臺或生物安全柜、細胞培養(yǎng)瓶、洗耳球。滅菌吸管、平皿、毛細吸管、離心管、剪刀、小鑷子、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。

PART2  操作步驟

（1）雞胚的孵育

受精雞胚放在蛋托上，大頭朝上，放入溫箱培養(yǎng)。在溫箱底部放上一盤水，溫度調至37.8 ℃。

（2）雞胚的發(fā)育過程

①觀察方法：將9~12天的雞胚取出，放入平皿中進行觀察。

②雞胚的發(fā)育：采用雞胚進行細胞培養(yǎng)時，應對雞胚的發(fā)育有一個初步了解。雞胚的發(fā)育是由受精卵開始的。它在通過輸卵管時，已開始分裂，當產卵時已在卵黃上部形成一層細胞稱為胚盤，在適宜的條件下胚盤繼續(xù)分裂生長。在發(fā)育過程中從卵黃和卵白中獲取養(yǎng)料和水分，由于胚體和卵黃分開的緣故，胚胎只通過卵黃帶與卵黃相連。發(fā)育的早期形成3個胚層，即外胚層、中胚層和內胚層，由此形成的胚胎的各個器官和組織。一般孵育至3天出現尿囊，為直腸側部分的膨出物，尿囊膜是由內胚層和中胚層構成的。至第4~5天胚體出現羊膜，尿囊膜及絨毛膜層包被。羊膜系由外胚層和中胚層組成，開始時緊貼于胚體上，后來腔內逐漸充滿羊水。尿囊膜在生長發(fā)育的過程中，與絨毛膜相連而成絨毛尿囊膜，此膜由三層細胞組成：外層為外胚層，內層為內胚層，中間為中胚層，其中有很多血管，有兩條主動脈自卵黃囊延伸到此膜中，與此并行有兩條主靜脈，匯成一較大的尿囊靜脈。絨毛尿囊膜是雞胚的呼吸器官，位于殼膜之內。此膜生長發(fā)育很快，第10 天已包圍了整個雞胚，此時雞胚已出現羽毛，呼吸道的發(fā)育在第12~15天出現。胚胎體積逐漸增大時，胚胎腔外體液日趨減少，孵出小雞時已無胚胎腔外體液。在發(fā)育早期，尿囊液及羊水的成分與生理鹽水溶液相差無幾，12天后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔積累了腎臟的排泄物，因此，在12天或13他后，尿囊液由于尿酸鹽的存在，使原來透明的液體呈現混濁。尿囊液的酸堿度在7~12天期間呈弱堿性，在孵育的末期為pH 6.0。6~13天雞胚羊水的平均量為5~10 mL，至13天有時可達10 mL。卵白的水分在發(fā)育的最初7天中轉移到卵黃囊內，在第16 天卵白轉人羊水腔為胚胎所吞食。卵黃在發(fā)育時逐漸被一層細胞包圍，自12天以后卵黃逐漸干燥，在孵出之后24~48 h，整個卵黃囊被吸入小雞腹腔內，供維雞出生后最初幾天的營養(yǎng)。

（3）雞胚原代的細胞培養(yǎng)

①消毒：選9~12天的雞胚2~3個放入超凈工作臺中，大頭（氣室）朝上放置，先用碘酊棉，消毒氣室部位。

②取雞胚：用鑷子剝去頭、四肢及內臟，洗2~3次，用Hank's液洗去紅細胞，吸去液體。

③剪碎雞胚及清洗：用小剪刀將雞胚反復剪碎成泥狀，加Hank's液，吸入細胞培養(yǎng)瓶，稍靜置，讓組織下沉,吸去液體。用Hank's液洗2~3次,吸去液體，以去除紅細胞等。

④加胰酶：根據組織的多少加人一定量的0.25%胰酶，胰酶的量以將組織塊浸泡在胰酶中為適中，一個雞胚一般加0.25%的胰酶4~5 mL。

⑤消化：用膠塞封緊，輕搖均勻，置4℃冰箱靜置過夜或37℃水浴消化1 h。

⑥洗去胰酶：消化完畢后，吸出胰酶，用Hank's液或PBS洗3次以洗去胰酶，吸去洗液后。洗時注意輕搖，如猛烈搖動，會將組織塊搖散，吸去洗液后，用營養(yǎng)液將細胞洗出，放入培養(yǎng)瓶。

⑦計數培養(yǎng)：加人適量的培養(yǎng)液(10~20 mL)，用吸管反復吹打形成細胞懸液，用細胞計數法，計算每毫升營養(yǎng)液中的細胞數，根據所計算的細胞數，將原液稀釋成106個/mL。將稀釋好的細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，一般200 mL培養(yǎng)瓶，放15~20 mL培養(yǎng)液，節(jié)約時可放10 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的量以覆蓋瓶底為適中。

⑧放入37℃ 、5%CO2溫箱培養(yǎng)：培養(yǎng)時，培養(yǎng)瓶的蓋不要擰得太緊，以不會下掉為度，以便CO2進入。培養(yǎng)1~2天后長成單層細胞，即可應用。

PART3  注意事項

1

全部操作過程應在無菌條件下完成。

2

放入5%CO2溫箱培養(yǎng)的目的是5%CO2能調節(jié)培養(yǎng)瓶中的pH，使之在一個星期或更長時間pH保持不變。
 

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