Knock-in
對于Knock-in,目前還存在一定的難度,大多數(shù)的出版物只能實現(xiàn)10-40%的敲入效率,不同位點也存在差異。Nature Biotechnology今年5月的一篇出版物利用獨有的SLEEK (SeLection by Essential-gene Exon Knock-in)技術可以在T細胞上實現(xiàn)超過90%的KI效率,同樣在其他常用的免疫細胞如NK,B cell,IPSC等細胞都實現(xiàn)了非常高的KI效率。
對于常規(guī)的KI實驗,我們依然可以從以下方面考量進行進一步優(yōu)化:
Donor DNA用量的測試
▲ Theodore L Roth et al., 2018
▲ Zelda Odé et al., 2020
HA長度
HA的長度會影響KI的效率,但并不意味著越長越好。
▲ Zelda Odé et al., 2020
▲ Soyoung A. Oh et al., 2022
HA修飾
▲ Brian R. Shy et al., 2021
▲ Jonas Kath et al., 2022
特殊成分提高HDR效率的測試
也有文獻結果表明PGA對KI的效率沒有幫助,僅供參考。
▲ Ya-Wen Fu et al., 2021
▲ David N. Nguyen et al., 2020
選擇dsDNA或ssDNA或AAV載體進行KI
dsDNA會隨著用量的增加顯著增加對細胞活率的影響。
▲ Theodore L Roth et al., 2018
HDR Enhancer
▲ Jonas Kath et al., 2022
甚至HDR, RNP, 細胞的混勻順序也可能會對結果造成影響
▲ Theodore L Roth et al., 2018
電轉(zhuǎn)前后培養(yǎng)體系
▲ Theodore L Roth et al., 2018
Nucleofection 條件優(yōu)化
通常可以參考KO的條件進行KI實驗,但依然可以依照具體的實驗需求調(diào)整。
▲ Theodore L Roth et al., 2018
▲ Soyoung A. Oh et al., 2022
對于Knock-in,還可以通過其他手段提升結果,如PAM and Track mutations, 具體內(nèi)容可以參考如Cas蛋白或sgRNA供應商。
通常KO不會對細胞的活率產(chǎn)生太大影響,但是對于KI,需要用到donor DNA,如dsDNA,或者使用更強的電轉(zhuǎn)染條件,這些可能會導致活率的負面影響。