重組蛋白檢測在各種細胞實驗中的重要作用介紹
為了保證重組蛋白產(chǎn)品的生物活性，MCE 建立了數(shù)種基于細胞實驗的測活方法進行檢測，這些方法主要包括：細胞增殖實驗、細胞毒性實驗、細胞粘附實驗、趨化試驗、細胞因子產(chǎn)生實驗、細胞分化實驗等。
細胞增殖實驗，在分子生物實驗中非常重要，它是評價細胞生長、代謝和活力狀況的重要指標(biāo)。常用的方法包括基于細胞活力檢測的 MTT 檢測法和 CCK8 檢測法等。
許多細胞生長因子 (如 EGF、bFGF 和 VEGF 等增殖因子) 與細胞增殖、分化和存活相關(guān)，其作用是通過結(jié)合細胞表面的跨膜受體，刺激受體的內(nèi)在蛋白質(zhì) (酪氨酸激酶) 活性，引發(fā)下游信號通路級聯(lián)反應(yīng)，使細胞內(nèi)發(fā)生各種生化變化，比如增加細胞核中的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等，最終導(dǎo)致細胞增殖�；谶@種功能，我們選擇細胞增殖實驗來表征和驗證這類蛋白質(zhì)的生物活性。
細胞毒性實驗，主要評價細胞損傷、細胞生長、細胞代謝變化的情況，常用的檢測方法也是基于細胞活力的 CCK8 檢測法。炎性因子 TNF-α 作為腫瘤壞死因子超家族的成員，是免疫系統(tǒng)細胞 (活化的單核/巨噬細胞等) 在急性炎癥過程中產(chǎn)生的炎癥細胞因子，可以與細胞表面的幾種不同受體結(jié)合 (主要的 TNF-α 受體是 TNFR1 和 TNFR2)，通過介導(dǎo)細胞存活和細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和正常功能[1][2]。
基于 TNF-α 誘導(dǎo)細胞凋亡的功能，我們建立細胞毒性實驗來是很好的檢測方法。用放線菌素 D 處理腫瘤細胞 (如小鼠成纖維細胞株 L-929) 可明顯增強 TNF-α 殺傷腫瘤細胞的活性。
圖 1. Transwell 小室檢測原理圖[3]。
常用分子生物學(xué)測定法 (qRT-PCR)，也稱為報告基因法，通過檢測細胞內(nèi)細胞因子的基因或 mRNA 的量，推算出細胞因子的產(chǎn)生量。
堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 在大多數(shù)細胞類型中均有表達，但其在具有更新、分化潛能的細胞中呈高水平表達。通過 ALP 活性測定來評估生長分化因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等對細胞分化和增殖的影響。
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參考文獻：
[1] Locksley R M, Killeen N, et al. “The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology.” Cell, 2001, 104(4): 487-501.
[2] Ciebiera M, Włodarczyk M, et al. “The Role of Tumor Necrosis Factor α in the Biology of Uterine Fibroids and the Related Symptoms.” Int J Mol Sci. 2018 Dec 4;19(12):3869.
[3] Justus, C.R., Marie, M.A., et al. “Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays.“ Cell Viability Assays. Methods in Molecular Biology, 2023, vol 2644. Humana, New York, NY.
