抗犬冠狀病毒（CCV）抗體的制備及在 WB、免疫層析中的應(yīng)用

抗犬冠狀病毒（CCV）抗體的制備及在 WB、免疫層析中的應(yīng)用
一、抗犬冠狀病毒（CCV）抗體的制備
（一）抗原制備：CCV 關(guān)鍵抗原的篩選與表達(dá)
CCV 抗原蛋白選擇
核衣殼蛋白（N 蛋白）：免疫原性強(qiáng)，保守性高，是制備抗體的首選抗原（可通過基因工程表達(dá)重組 N 蛋白）。
棘突蛋白（S 蛋白）：含中和表位，可用于制備中和抗體，但空間構(gòu)象復(fù)雜，表達(dá)難度較高。
重組抗原的表達(dá)與純化
基因克隆：從 CCV 毒株（如 Mebus 株）中擴(kuò)增 N 蛋白或 S 蛋白基因，插入原核（如 E. coli）或真核表達(dá)載體（如昆蟲細(xì)胞）。
蛋白表達(dá)與純化：通過 IPTG 誘導(dǎo)原核表達(dá)，利用 Ni-NTA 親和層析或凝膠過濾純化重組蛋白，確�？乖�純度（＞95%）。

（二）多克隆抗體（pAb）制備流程
動(dòng)物免疫
初次免疫：重組抗原與弗氏完全佐劑等體積乳化，背部多點(diǎn)皮下注射（抗原量 50-100 μg / 只）。
加強(qiáng)免疫：每 2-3 周用弗氏不完全佐劑乳化抗原 booster 免疫，共 3-4 次，每次抗原量 50 μg / 只。
效價(jià)檢測：末次免疫后 7-10 天，采集少量血清，通過 ELISA 檢測抗體效價(jià)（≥1:10,000 視為合格）。
免疫動(dòng)物選擇：健康成年新西蘭白兔（體重 2-3 kg）或 Balb/c 小鼠，免疫前采集血清作為陰性對照。

免疫方案：
抗體純化與鑒定
血清采集與粗提：頸動(dòng)脈采血或心臟采血，分離血清，通過硫酸銨沉淀法（40% 飽和度）初步純化 IgG。
親和層析純化：使用 Protein A/G 瓊脂糖樹脂進(jìn)一步純化抗體，去除雜蛋白，通過 SDS-PAGE 驗(yàn)證純度。

（三）單克隆抗體（mAb）制備流程
雜交瘤細(xì)胞構(gòu)建
脾細(xì)胞制備：對免疫后抗體效價(jià)高的小鼠（如 Balb/c），取脾臟研磨成單細(xì)胞懸液。
細(xì)胞融合：與骨髓瘤細(xì)胞（如 SP2/0）在 PEG 作用下融合，接種于 HAT 選擇性培養(yǎng)基，篩選雜交瘤細(xì)胞。
克隆化與篩選：通過有限稀釋法克隆化雜交瘤細(xì)胞，利用間接 ELISA 篩選能穩(wěn)定分泌抗 CCV 抗體的細(xì)胞株。
腹水制備與抗體純化
小鼠腹腔注射：將陽性雜交瘤細(xì)胞注射至經(jīng)降植烷預(yù)處理的小鼠腹腔，7-10 天后收集腹水。
抗體純化：腹水經(jīng) Protein G 親和層析純化，通過 ELISA 和 Western blot 驗(yàn)證抗體特異性。

二、抗 CCV 抗體在 Western Blot（WB）中的應(yīng)用
（一）WB 檢測 CCV 的實(shí)驗(yàn)流程
樣品制備
感染 CCV 的犬腸組織或細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)超聲破碎或反復(fù)凍融后，離心取上清，BCA 法測定蛋白濃度。
電泳與轉(zhuǎn)膜
SDS-PAGE 電泳：將樣品與 Loading Buffer 混合，95℃變性 5 min，上樣至 10% SDS-PAGE 凝膠，80-120 V 電泳至蛋白分離。
轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜（200 mA，1-2 h），用 5% 脫脂奶粉或 BSA 封閉 1 h（室溫）。

抗體孵育與顯色
一抗孵育：抗 CCV 多克隆抗體或單克隆抗體（1:1000-1:5000 稀釋），4℃孵育過夜。
二抗孵育：HRP 標(biāo)記的羊抗兔 / 鼠 IgG（1:5000 稀釋），室溫孵育 1 h，TBST 洗膜 3 次（每次 10 min）。
顯色：ECL 化學(xué)發(fā)光試劑孵育膜 5 min，曝光顯影，觀察 CCV 特異性條帶（N 蛋白約 50 kDa，S 蛋白約 180 kDa）。

（二）關(guān)鍵注意事項(xiàng)
抗體特異性驗(yàn)證：需設(shè)置未感染 CCV 的陰性對照，排除非特異性結(jié)合。
封閉劑選擇：部分抗體可能與脫脂奶粉中的蛋白交叉反應(yīng)，可改用 BSA 封閉。

三、抗 CCV 抗體在免疫層析中的應(yīng)用
（一）免疫層析試紙條的設(shè)計(jì)原理
檢測原理：基于雙抗體夾心或競爭法，以抗 CCV 抗體作為捕獲抗體（固定于硝酸纖維素膜 NC 膜的檢測線 T 線）和標(biāo)記抗體（膠體金或乳膠微球偶聯(lián)，作為示蹤物）。

（二）雙抗體夾心法試紙條制備流程
材料準(zhǔn)備
NC 膜：包被抗 CCV mAb（T 線，1-2 mg/mL）和羊抗鼠 IgG（C 線，1 mg/mL）；
結(jié)合墊：膠體金標(biāo)記抗 CCV 另一表位的 mAb（標(biāo)記抗體，10-20 μg/mL），干燥備用。
試紙條組裝與切割
按順序組裝樣品墊、結(jié)合墊、NC 膜、吸水墊，用層析卡殼固定，切割成 3-4 mm 寬的試紙條。
檢測流程若樣品含 CCV，標(biāo)記抗體與病毒結(jié)合，遷移至 T 線時(shí)被捕獲抗體識別，形成 “金標(biāo)抗體 - 病毒 - 捕獲抗體” 復(fù)合物，顯紅色條帶；
線為質(zhì)控線，無論樣品是否陽性均應(yīng)顯色，驗(yàn)證試紙條有效性。
樣品（犬糞便懸液或血清）滴加至樣品墊，通過毛細(xì)作用遷移：

（三）競爭法檢測設(shè)計(jì)（適用于小分子抗原，此處以 CCV 為例）
若抗體識別病毒表面短肽表位，可設(shè)計(jì)競爭法：
T 線包被 CCV 重組抗原，結(jié)合墊標(biāo)記抗 CCV 抗體；
樣品中若含 CCV，標(biāo)記抗體優(yōu)先與病毒結(jié)合，導(dǎo)致 T 線抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體減少，條帶顏色變淺或消失，通過顏色強(qiáng)度判斷陽性程度。

四、抗體應(yīng)用的關(guān)鍵優(yōu)化點(diǎn)
抗體效價(jià)與親和力
WB 檢測需高親和力抗體（降低背景信號），免疫層析需兼顧效價(jià)與穩(wěn)定性（標(biāo)記抗體需耐鹽、耐蛋白酶）。
交叉反應(yīng)驗(yàn)證
犬冠狀病毒與貓冠狀病毒（FCoV）、犬細(xì)小病毒（CPV）等可能存在低同源性，需用交叉抗原（如 FCoV）驗(yàn)證抗體特異性，避免假陽性。

臨床樣本適用性
免疫層析試紙條需用臨床確診的 CCV 陽性糞便（≥100 份）和陰性樣本（健康犬、其他腸道疾病犬）驗(yàn)證靈敏度（≥90%）和特異性（≥95%）。

五、應(yīng)用價(jià)值與展望
疾病快速診斷：免疫層析試紙條可用于犬冠狀病毒感染的現(xiàn)場快速檢測，適合基層臨床和流行病學(xué)調(diào)查。
科研與疫苗評價(jià)：WB 檢測可用于 CCV 感染細(xì)胞或動(dòng)物模型中病毒蛋白表達(dá)的定性 / 定量分析，輔助疫苗免疫效果評估。后續(xù)優(yōu)化方向：通過抗體人源化或納米抗體改造，提高抗體穩(wěn)定性
和檢測靈敏度，開發(fā) POCT（即時(shí)檢測）產(chǎn)品。
通過合理設(shè)計(jì)抗體制備流程及檢測方法，抗 CCV 抗體可在犬冠狀病毒的診斷、研究及防控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。