抗豬A型輪狀病毒（PoRV A）單克隆抗體制備方法及應用場景

抗豬 A 型輪狀病毒（Porcine Rotavirus A, PoRV A）單克隆抗體在病毒檢測、致病機制研究及疫苗開發(fā)中具有重要價值。以下從毒株型號、抗體特性、制備方法、特異性參數及應用場景等方面詳細說明相關參數：

豬 A 型輪狀病毒根據 VP7 糖蛋白（G 型）和 VP4 蛋白酶敏感蛋白（P 型）分為不同血清型，常見毒株如下：

• VP7 糖蛋白： 
  • 構成病毒外衣殼，含中和表位（Neutralization Epitope, NE） 和型特異性表位（Type-Specific Epitope），如 G5 型 VP7 的 D 區(qū)（氨基酸 240-280）為保守中和區(qū)。
• VP4 蛋白： 
  • 經蛋白酶切割后形成 VP5和 VP8亞基，VP8 * 含宿主細胞受體結合域，是 P 型分型的關鍵抗原。

1. 雜交瘤細胞株構建：

   • 免疫原：重組 VP7 蛋白（如 G5 型 VP7 的 1-300aa 片段，桿狀病毒表達后純化）或滅活病毒顆粒（OSU 株）。
   • 融合細胞：SP2/0 骨髓瘤細胞與免疫小鼠（BALB/c）的脾細胞融合，通過間接 ELISA 篩選陽性克隆。
   • 抗體純化：Protein A 親和層析，純度＞98%，內毒素＜0.05 EU/mg。

2. 特異性驗證指標：

   • 交叉反應： 
     • 與豬 B 型輪狀病毒（PoRV B）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）等無交叉反應（ELISA OD 值＜0.05）。
     • 與同屬人輪狀病毒（HRV）、牛輪狀病毒（BRV）交叉反應率＜2%。
   • 中和活性：對同源毒株（如 G5P [7] OSU 株）的空斑減少率≥90%（抗體濃度 10 μg/mL）。

1. 雙抗體夾心 ELISA： 
   • 包被抗體：4G2 株單抗（5 μg/mL），檢測抗體：HRP 標記的 6H9 株單抗（1:10000 稀釋），檢測限（LOD）=5 ng/mL PoRV 抗原。
2. 免疫熒光（IFA）： 
   • 抗體濃度：8 μg/mL，可識別感染 PoRV 的 MA104 細胞內病毒抗原，熒光強度（MFI）＞1500。
3. 病毒中和試驗（VNT）： 
   • 中和型單抗（如針對 VP7 的 4G2 株）在 1:256 稀釋時可完全抑制 OSU 株感染，IC₅₀測定值為 2.3 ng/mL。

• 疫苗效力評價：單抗可用于檢測免疫仔豬血清中的中和抗體滴度，評估 G5 型疫苗對同源 / 異源毒株的保護效果。
• 抗原變異監(jiān)測：通過單抗結合試驗（Monoclonal Antibody Binding Assay, MABA）分析野外毒株 VP7/VP4 的抗原漂移，指導疫苗株更新。

1. 血清型特異性：由于 PoRV A 不同 G/P 型的 VP7/VP4 抗原差異顯著，建議根據目標血清型（如 G5 或 G9）選擇對應的單克隆抗體。
2. 交叉反應控制：部分廣譜單抗可能與豬杯狀病毒（如諾如病毒）存在低水平交叉反應，需通過陰性細胞裂解液吸附法排除干擾。
3. 應用場景優(yōu)化： 
   • 檢測臨床樣品（如腹瀉糞便）時，建議使用針對 VP6 群特異性抗原的單抗（如泛 A 型單抗）進行初篩，再用型特異性單抗分型。
   • 中和試驗需在含胰酶（1 μg/mL）的培養(yǎng)基中進行，以模擬腸道蛋白酶對 VP4 的激活作用。

如需針對特定地區(qū)流行毒株的單抗，建議結合當地 PoRV G/P 型監(jiān)測數據（如通過 RT-PCR 分型）選擇匹配的抗體株，并在使用前通過交叉反應試驗驗證特異性。