豬偽狂犬病毒（PRV-gB） 蛋白的分子結(jié)構(gòu)及制備策略

豬偽狂犬病毒（PRV）屬于皰疹病毒科 α 皰疹病毒亞科，其基因組編碼 11 種糖蛋白，其中 gB（糖蛋白 B）是病毒包膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有以下核心功能：

• 病毒入侵關(guān)鍵因子：gB 與宿主細(xì)胞表面受體（如 nectin-1、HVEM）結(jié)合，介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，是病毒感染的必需蛋白。
• 免疫原性核心抗原：gB 蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體及細(xì)胞免疫，是疫苗設(shè)計(jì)的主要靶點(diǎn)之一。

1. 氨基酸序列與結(jié)構(gòu)域劃分

   • PRV gB 基因全長(zhǎng)約 3.8 kb，編碼 1195-1205 個(gè)氨基酸（不同毒株略有差異），前 18-22 個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，C 端 20-30 個(gè)氨基酸為跨膜區(qū)，其余為胞外區(qū)。
   • 胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域： 
     • DⅠ 區(qū)（N 端結(jié)構(gòu)域）：含保守的融合肽（fusion peptide），參與膜融合；
     • DⅡ 區(qū)（中部結(jié)構(gòu)域）：含多個(gè) β 折疊和二硫鍵，維持蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性；
     • DⅢ 區(qū)（C 端結(jié)構(gòu)域）：含免疫優(yōu)勢(shì)表位，是中和抗體的主要結(jié)合區(qū)域。

2. 三維結(jié)構(gòu)與功能關(guān)聯(lián)

   • gB 蛋白以同源三聚體形式存在于病毒包膜上，電鏡下呈 “柱狀” 結(jié)構(gòu)，高度糖基化（約 12-15 個(gè) N - 糖基化位點(diǎn)）。
   • 關(guān)鍵功能位點(diǎn)： 
     • 融合肽區(qū)（aa 40-60）：保守疏水氨基酸（如 Leu、Ile）突變可導(dǎo)致病毒感染力顯著下降；
     • 二硫鍵（如 Cys100-Cys150、Cys200-Cys250）：維持 DⅠ-DⅡ 區(qū)空間構(gòu)象，缺失會(huì)破壞三聚體組裝。

• 理論分子量：未糖基化的 gB 蛋白多肽鏈約 130 kDa，但因廣泛糖基化，天然 gB 蛋白在 SDS-PAGE 中遷移至 150-180 kDa。
• 糖基化差異： 
  • 強(qiáng)毒株（如 Bartha-K61 疫苗株）與野毒株（如 TJ 株）的 gB 糖基化模式存在差異，野毒株可能因糖基化位點(diǎn)增加（如 N300、N500 位點(diǎn)）導(dǎo)致分子量更大，免疫逃逸能力增強(qiáng)。

• 難點(diǎn)：gB 胞外區(qū)含大量疏水結(jié)構(gòu)域，在大腸桿菌中易形成包涵體，且缺乏糖基化導(dǎo)致抗原性降低。
• 改進(jìn)方案： 
  • 分段表達(dá)：將 DⅢ 區(qū)（aa 800-1200）單獨(dú)表達(dá)，利用 pET-28a 載體融合 Trx 標(biāo)簽（減少聚集）；
  • 體外糖基化模擬：通過(guò)化學(xué)方法在重組蛋白的 Ser/Thr 位點(diǎn)連接聚糖，改善抗原構(gòu)象。

• 親和層析：利用 gB 蛋白 C 端 His 標(biāo)簽（需避免破壞跨膜區(qū)），采用 Ni-NTA 樹(shù)脂，200 mM 咪唑洗脫，純度可達(dá) 95% 以上；
• 復(fù)性優(yōu)化：包涵體溶解后，通過(guò)梯度降低尿素濃度（8 M→1 M）并添加氧化還原對(duì)（GSH/GSSG=10:1），促進(jìn)二硫鍵正確折疊。

1. 疫苗研發(fā)中的核心地位

• 傳統(tǒng)滅活疫苗與亞單位疫苗：以 gB 蛋白為主要抗原，如 Bartha-K61 株 gB 蛋白與佐劑聯(lián)用，可誘導(dǎo)高效中和抗體，但對(duì)變異株保護(hù)力有限。
• 基因工程疫苗： 
  • 重組活載體疫苗：將 gB 基因插入痘病毒載體，構(gòu)建多價(jià)疫苗；
  • 病毒樣顆粒（VLP）疫苗：共表達(dá) gB、gD、gH 蛋白，組裝成 VLP，免疫原性優(yōu)于單一蛋白。

2. 診斷試劑的創(chuàng)新應(yīng)用

• ELISA 檢測(cè)：以重組 gB 蛋白為包被抗原，可區(qū)分自然感染與疫苗免疫（如鑒別 Bartha-K61 株 gB 與野毒株 gB 的抗原表位差異）；
• 中和試驗(yàn)：利用 gB 蛋白特異性單克隆抗體（如針對(duì) DⅢ 區(qū) aa 1000-1100 表位的抗體）建立中和阻斷 ELISA，提高變異株檢測(cè)靈敏度。

1. 野毒株 gB 的序列變異熱點(diǎn)

• 近年來(lái)流行的 PRV 變異株（如 China PRV 2012-like 株）在 gB 的 DⅢ 區(qū)存在多個(gè)氨基酸替換（如 aa 1050-1060 位的 N→D 突變），導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗誘導(dǎo)的中和抗體結(jié)合效率下降約 30%。
• 糖基化位點(diǎn)變異：野毒株 gB 新增 N450 糖基化位點(diǎn)，可能通過(guò)糖鏈遮蔽抗原表位，介導(dǎo)免疫逃逸。

2. 應(yīng)對(duì)策略

• 廣譜 gB 抗原設(shè)計(jì)：分析不同變異株 gB 的保守表位（如 DⅠ 區(qū) aa 50-70），設(shè)計(jì)多表位串聯(lián)重組蛋白；
• 結(jié)構(gòu)疫苗學(xué)：基于 gB 三聚體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（分辨率 2.8 Å），靶向融合肽等保守區(qū)域設(shè)計(jì)小分子抑制劑或疫苗。

1. 單顆粒冷凍電鏡（Cryo-EM）：解析 gB 三聚體與宿主受體（nectin-1）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，揭示膜融合機(jī)制；
2. 酵母表面展示技術(shù)：篩選針對(duì)變異株 gB 表位的高親和力納米抗體，用于診斷或中和治療；
3. 反向遺傳學(xué)：構(gòu)建 gB 定點(diǎn)突變株（如破壞融合肽），開(kāi)發(fā)復(fù)制缺陷型活疫苗。