豬瘟E2病毒單克隆抗體的制備流程及關鍵參數(shù)

一、抗體結構參數(shù)
豬瘟 E2 單克隆抗體（mAb）為典型的鼠源 IgG 類抗體（多數(shù)為 IgG1 或 IgG2a 亞型），基本結構如下：
整體結構：由 2 條重鏈（H 鏈）和 2 條輕鏈（L 鏈）通過二硫鍵連接形成 “Y” 型結構，分子量約 150 kDa。
功能區(qū)域：
可變區(qū)（V 區(qū)）：重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）組成抗原結合位點（CDR，互補決定區(qū)），負責特異性識別 E2 蛋白的表位（線性或構象表位）。
恒定區(qū)（C 區(qū)）：重鏈恒定區(qū)（CH1-CH3）決定抗體亞型（如 IgG1 的 Fc 段可與補體或細胞表面 Fc 受體結合），輕鏈恒定區(qū)（CL）輔助維持結構穩(wěn)定。
糖基化修飾：部分單抗的 Fc 段存在 N - 糖基化位點，影響抗體的半衰期和效應功能（如補體依賴的細胞毒性，CDC）。

二、靶向的 E2 蛋白毒株
E2 蛋白是 CSFV 的主要抗原，不同毒株的 E2 序列存在一定變異，但核心表位（尤其是中和表位）相對保守。單抗靶向的常見毒株包括：
經典毒株：如 C 株（兔化弱毒疫苗株，E2 基因高度保守）、Alfort 株、Brescia 株。
流行野毒株：如國內分離的 Shimen 株、GXWZ02 株，歐洲的 Paderborn 株等。
重組毒株：通過原核（如大腸桿菌）或真核系統(tǒng)（如桿狀病毒、CHO 細胞）表達的重組 E2 蛋白（保留天然構象表位），是單抗制備的主要免疫原來源。
注：優(yōu)質單抗通常能識別多個流行毒株的 E2 蛋白（因保守表位交叉識別），但對基因高度變異的毒株可能存在識別效率差異。

三、制備流程及關鍵參數(shù)
1. 制備步驟
免疫原：重組 E2 蛋白（純度≥90%，濃度 50-100μg / 劑）或滅活 CSFV（滴度≥10⁶ TCID₅₀/mL）。
免疫方案：BALB/c 小鼠腹腔或皮下免疫，基礎免疫 3 次（間隔 2 周），加強免疫 1 次（融合前 3 天），血清效價需≥1:10⁴（ELISA 檢測）。
細胞融合：脾臟 B 細胞與 SP2/0 骨髓瘤細胞融合，融合率≥30%，雜交瘤克隆形成率≥50%。
篩選方法：
初篩：間接 ELISA（包被重組 E2 蛋白，OD450 值≥0.8 且陰性對照 < 0.2 為陽性）。
復篩：免疫熒光（IFA，感染 CSFV 的 PK-15 細胞中出現(xiàn)特異性熒光）、中和試驗（檢測病毒中和活性）。
克隆純化：有限稀釋法克隆 3 次以上，確保雜交瘤細胞株單克隆性（染色體數(shù)目穩(wěn)定，約 90-100 條）。
抗體生產：腹水誘生（效價 1:10⁵-10⁷）或無血清培養(yǎng)（濃度 50-200μg/mL），Protein G 親和純化后純度≥95%。
2. 制備關鍵參數(shù)
雜交瘤細胞穩(wěn)定性：連續(xù)傳代 30 次以上仍能穩(wěn)定分泌抗體（效價波動≤2 倍）。
抗體效價：ELISA 效價≥1:10⁶（腹水）或 1:10⁵（細胞上清）；中和效價（NT₅₀）≥1:128（針對強毒株）。

四、特異性與交叉反應率
1. 特異性
抗原特異性：僅與 CSFV E2 蛋白結合，不識別 CSFV 的其他結構蛋白（如 E0、E1）或非結構蛋白（如 NS3）。
病毒特異性：通過 IFA 或中和試驗驗證，僅與 CSFV 反應，不與其他豬源病毒（如豬圓環(huán)病毒 PCV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 PRRSV）交叉反應。
2. 交叉反應率
與瘟病毒屬其他病毒：因 CSFV 與牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、邊界病病毒（BDV）同屬瘟病毒屬，部分單抗可能存在交叉（交叉率≤5% 為優(yōu)質單抗），需通過 ELISA 或中和試驗排除（如對 BVDV 的 OD450 值 / CSFV OD450 值 < 0.1）。
與不同 CSFV 毒株：對主流流行株（如 2.1 亞型、2.2 亞型）的識別率≥95%，對基因變異株（如部分 3.4 亞型）的交叉率可能降至 80%-90%（需通過序列比對確認表位保守性）。

五、其他關鍵參數(shù)
親和力：通過表面等離子體共振（SPR）測定，解離常數(shù)（KD）通常為 10⁻⁸-10⁻¹⁰ M（KD 值越小，親和力越高）。
熱穩(wěn)定性：37℃放置 7 天，效價保留率≥80%；-20℃凍存 1 年，效價無顯著下降。
應用適應性：適合 ELISA、IFA、Western blot、中和試驗等方法，稀釋倍數(shù)范圍寬（如 ELISA 工作濃度 1:5000-1:20000）。