Plant Physiol | DAP-seq助力揭示楊樹根系抗旱新機制
在全球氣候變暖背景下，干旱已成為威脅植物生長的重大挑戰(zhàn)。在植物中，根系是干旱脅迫信號的主要感知器，其發(fā)育直接影響抗旱能力。然而，在樹木中不定根（ARs）和側(cè)根（LRs）對非生物脅迫的協(xié)調(diào)反應所依據(jù)的理論仍不清晰。
近日，東北林業(yè)大學-楊靜莉研究團隊在Plant Physiology（IF=6.5）發(fā)表題為PuUBL5-mediated ZINC FINGER PROTEIN 1 stability is critical for root development under drought stress in Populus ussuriensis的研究論文，該研究借助DAP-seq技術(shù)揭示了楊樹通過“分子開關”PuZFP1協(xié)調(diào)側(cè)根抑制與不定根伸長的抗旱策略，為抗旱林木的遺傳改良提供了新的理論依據(jù)。
近日，東北林業(yè)大學-楊靜莉研究團隊在Plant Physiology（IF=6.5）發(fā)表題為PuUBL5-mediated ZINC FINGER PROTEIN 1 stability is critical for root development under drought stress in Populus ussuriensis的研究論文，該研究借助DAP-seq技術(shù)揭示了楊樹通過“分子開關”PuZFP1協(xié)調(diào)側(cè)根抑制與不定根伸長的抗旱策略，為抗旱林木的遺傳改良提供了新的理論依據(jù)。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
PuZFP1含有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域（氨基酸43-65）和一個C端高度保守的EAR抑制基序（DLSLRL），與擬南芥AtZP1高度同源（結(jié)構(gòu)相似性＞60%），定位在細胞核與細胞質(zhì)。RT-qPCR和啟動子驅(qū)動的GUS染色結(jié)果顯示，干旱和ABA處理顯著誘導PuZFP1表達，并且在于根系分化區(qū)（DZ）和伸長區(qū)（EZ）特異性表達，與側(cè)根發(fā)生和不定根伸長區(qū)域重疊。酵母轉(zhuǎn)錄激活實驗和Gal4-GUS/LUC系統(tǒng)結(jié)果表明，PuZFP1是轉(zhuǎn)錄抑制因子，并且EAR基序是PuZFP1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能的必需結(jié)構(gòu)。通過構(gòu)建PuZFP1過表達（OE）和RNA干擾（RNAi）株系，發(fā)現(xiàn)PuZFP1負調(diào)控側(cè)根（LR）形成，正調(diào)控不定根（AR）伸長，在楊樹根系響應干旱脅迫中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用。
PuZFP1含有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域（氨基酸43-65）和一個C端高度保守的EAR抑制基序（DLSLRL），與擬南芥AtZP1高度同源（結(jié)構(gòu)相似性＞60%），定位在細胞核與細胞質(zhì)。RT-qPCR和啟動子驅(qū)動的GUS染色結(jié)果顯示，干旱和ABA處理顯著誘導PuZFP1表達，并且在于根系分化區(qū)（DZ）和伸長區(qū)（EZ）特異性表達，與側(cè)根發(fā)生和不定根伸長區(qū)域重疊。酵母轉(zhuǎn)錄激活實驗和Gal4-GUS/LUC系統(tǒng)結(jié)果表明，PuZFP1是轉(zhuǎn)錄抑制因子，并且EAR基序是PuZFP1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能的必需結(jié)構(gòu)。通過構(gòu)建PuZFP1過表達（OE）和RNA干擾（RNAi）株系，發(fā)現(xiàn)PuZFP1負調(diào)控側(cè)根（LR）形成，正調(diào)控不定根（AR）伸長，在楊樹根系響應干旱脅迫中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用。
圖1. PuZFP1的生物信息學和表達模式分析。
圖2. PuZFP1賦予楊樹抗旱能力。
圖3. PuZFP1賦予楊樹抗旱能力。
圖4. PuZFP1與PuUBL5相互作用，并發(fā)生PuUBL5介導的降解。
為確定PuZFP1的靶基因，研究團隊將DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，鑒定出PuZFP1的下游靶基因PuWRKY46和 PuEGR1。DAP-seq結(jié)果顯示，PuZFP1主要結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）附近，在所有的結(jié)合峰中，啟動子區(qū)占比19%，基因間區(qū)占比65%。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎琍uZFP1對這兩個基因的啟動子具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，同時ABA處理抑制了PuZFP1與靶基因啟動子的結(jié)合。
結(jié)合EMSA實驗和靶基因功能研究發(fā)現(xiàn)PuZFP1通過結(jié)合PuWRKY46啟動子中的CAGTG元件抑制其轉(zhuǎn)錄，進而阻斷側(cè)根原基形成；同時，通過抑制PuEGR1（含TTTTGTTT結(jié)合基序）的表達，解除對不定根伸長區(qū)（EZ）細胞伸長的抑制。
結(jié)合EMSA實驗和靶基因功能研究發(fā)現(xiàn)PuZFP1通過結(jié)合PuWRKY46啟動子中的CAGTG元件抑制其轉(zhuǎn)錄，進而阻斷側(cè)根原基形成；同時，通過抑制PuEGR1（含TTTTGTTT結(jié)合基序）的表達，解除對不定根伸長區(qū)（EZ）細胞伸長的抑制。
圖5. PuZFP1靶基因的鑒定和直接結(jié)合驗證。
圖6. PuWRKY46楊樹抗旱能力。
圖7. PuEGR1賦予楊樹抗旱能力。
結(jié)合激素信號分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PuZFP1通過協(xié)調(diào)脫落酸（ABA）與生長素（IAA）信號通路，雙向調(diào)控根系發(fā)育：在根系分化區(qū)（DZ），PuZFP1抑制靶基因PuWRKY46的表達，導致該區(qū)ABA含量升高、IAA含量降低，ABA/IAA比例升高，從而抑制側(cè)根（LR）原基的形成與萌發(fā)；而在伸長區(qū)（EZ），PuZFP1抑制PuEGR1的表達，使該區(qū)ABA含量降低、IAA含量升高，ABA/IAA比例降低，進而促進不定根（AR）細胞的伸長。這種ABA與生長素的時空比例調(diào)控，是PuZFP1介導根系結(jié)構(gòu)適應干旱脅迫的核心機制。
圖8. PuZFP1表達與ABA/auxin途徑聯(lián)合調(diào)控根系發(fā)育。
綜上所述，本研究揭示了PuUBL5-PuZFP1模塊通過ABA /auxin信號調(diào)控根系發(fā)育的機制，為楊樹抗旱分子育種提供了理論依據(jù)。
圖9. 楊樹PuZFP1-PuUBL5模塊響應干旱脅迫下的模型。
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