I 類(lèi) PI3Ks 激活小梁網(wǎng)細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)的自噬

Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells

Keywords: Autophagy; Glaucoma; Mechanical stress; PI3K; Primary cilia; Trabecular meshwork.

眼壓升高（IOP）是青光眼的主要危險(xiǎn)因素，其是由于房水（AH）通過(guò)小梁網(wǎng)（TM）/施萊姆管（SC）流出通道組織的引流障礙，導(dǎo)致眼壓穩(wěn)態(tài)中斷。流出通道中的細(xì)胞持續(xù)受到機(jī)械力的影響，如拉伸應(yīng)力和剪切應(yīng)力，分別是由 IOP 和 AH 流量的每日波動(dòng)引起。研究表明，TM 和 SC 細(xì)胞能夠通過(guò)各種生理反應(yīng)感知和響應(yīng)這些機(jī)械應(yīng)力，這被認(rèn)為是維持 IOP 穩(wěn)態(tài)所必需的內(nèi)在適應(yīng)機(jī)制。

自噬的激活是一種適應(yīng)性反應(yīng)，初級(jí)纖毛（PC）是拉伸和剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 TM 和 SC 細(xì)胞中自噬的關(guān)鍵機(jī)械傳感器。初級(jí)纖毛作為細(xì)胞的信號(hào)樞紐，參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)，PC 依賴(lài)性拉伸誘導(dǎo)的自噬是由人 TM（HTM）細(xì)胞中 AKT 和 SMAD2/3 信號(hào)之間的一種新型相互激活機(jī)制介導(dǎo)的。然而，上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件仍然難以捉摸。

磷酸磷脂酰肌醇（PIPs）是在真核細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)的必需磷脂，是各種細(xì)胞過(guò)程中膜蛋白的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括自噬。PIPs 由磷脂酰肌醇（PI）的第3、第4 和第5 位磷酸化產(chǎn)生，有7 種不同的 PIPs 衍生物。在第三位磷酸化的 PIPs [PI（3）P、PI（3,5）P2 和 PI（3,4,5）P3] 參與自噬誘導(dǎo)和吞噬泡的形成。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）是一種可使PI環(huán)上第3 位羥基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，其結(jié)構(gòu)可分為3 種類(lèi)型（I 類(lèi)、II 類(lèi)和 III 類(lèi)）。研究表明，I 類(lèi) PI3K 調(diào)節(jié) AKT 和 SMAD2/3 信號(hào)，并促進(jìn)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 SC 細(xì)胞自噬。

最近，在美國(guó)杜克大學(xué)眼科中心及斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院眼科團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，探索了 PI3Ks 和 PIPs 作為上游信號(hào)成分在機(jī)械拉伸的 HTM 細(xì)胞中 PC 依賴(lài)性自噬激活中的作用，研究首次報(bào)道了 PIK3CA-INPP4A/B 參與機(jī)械應(yīng)力下的自噬激活以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。研究成果發(fā)表于 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊題為“Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells”。

為了研究 I 類(lèi) PI3Ks 是否構(gòu)成響應(yīng)機(jī)械拉伸 TM 細(xì)胞中介導(dǎo)自噬激活的上游成分，首先分析了 PI3K 家族所有不同成員的催化亞基的 mRNA 表達(dá)水平。利用針對(duì)流出通道的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) TM 細(xì)胞中 PI3Ks 催化亞基的 5 種亞型在 mRNA 水平上顯著表達(dá)：IA 類(lèi) [PIK3CA（11.82%）、B（5.76%）和 D （3.75%）]、II 類(lèi) [PIK3C2A（18.59%）] 和 III 類(lèi) [PIK3C3（14.27%）]。

使用 PIK-75 對(duì) I 類(lèi) PI3Ks 進(jìn)行藥理學(xué)抑制，濃度遞增的 PIK-75（20 nM-2 μM）處理 HTM 細(xì)胞，隨后應(yīng)用循環(huán)機(jī)械拉伸（CMS，20% 或 8%應(yīng)變，1 Hz）。2 μM 的 PIK-75 處理完全降低了 CMS 誘導(dǎo)的 LC3 II 水平升高（圖1 A）。

最近一項(xiàng)關(guān)于造血干細(xì)胞的研究表明，PIK3CA、B 和 D 一起缺失，而不是單獨(dú)或成對(duì)缺失，會(huì)破壞自噬。為了研究這種可能性，使用針對(duì) PIK3CA、B 和 D 的 siRNA 對(duì) IA 類(lèi) PI3Ks 的催化亞基進(jìn)行單次或三次敲低，并評(píng)估機(jī)械拉伸細(xì)胞中的 LC3 II 水平。WB 分析顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，經(jīng)三重敲低的細(xì)胞中 CMS 誘導(dǎo)的 LC3 II 顯著降低（圖1 B）。與先前在造血干細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)一致，每個(gè)基因的單次敲除并不能阻止CMS誘導(dǎo)的LC3 II水平增加。

進(jìn)一步研究證實(shí)，在用表達(dá) RFP-GFP-LC3（Ad-tfLC3）的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的 HTM 細(xì)胞中抑制 I 類(lèi) PI3Ks 可防止 CMS 誘導(dǎo)的自噬體形成。與之前的研究一致，在 2 μM PIK-75 處理的CMS 刺激細(xì)胞中觀察到自噬數(shù)據(jù)（自噬體：黃色點(diǎn)；自噬溶酶體：紅色點(diǎn)）有質(zhì)的增加（圖1 C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，I 類(lèi) PI3K 催化亞基通過(guò)促進(jìn)自噬體的形成在調(diào)節(jié) CMS 誘導(dǎo)的自噬中發(fā)揮作用。

圖1 抑制 IA 類(lèi) PI3Ks 可防止 CMS 誘導(dǎo)的 HTM 細(xì)胞自噬。

接下來(lái)，研究了 II 類(lèi)和 III 類(lèi) PI3K 是否也有助于 TM 細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)的自噬激活。為此，沉默了 HTM 細(xì)胞中 PIK3C2A 的表達(dá)，并評(píng)估了 CMS 后的 LC3 II 水平，發(fā)現(xiàn)PIK3C2A敲低并不能阻止CMS 作用下TM 細(xì)胞中 LC3 II 的增加。此外，III 類(lèi) PI3K（PIK3C3）的敲低并未抑制 CMS 誘導(dǎo)的 TM 細(xì)胞自噬激活。這些結(jié)果表明，II 類(lèi) PI3Ks 和 III 類(lèi) PI3Ks 均未顯著促進(jìn) TM 細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)的自噬激活。

進(jìn)一步研究 I 類(lèi) PI3Ks 在 HTM 細(xì)胞中 PC 上的定位。研究人員專(zhuān)注于 IA 類(lèi) PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3D），因?yàn)樗鼈兪?TM 細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)烈的亞型。使用針對(duì)每種 I 類(lèi) PI3K 亞型的催化亞基的抗體以及乙�；� TUBA4A（Ac-TUBA4A（一種 PC 標(biāo)志物）進(jìn)行免疫共染色。結(jié)果顯示，PIK3CB 或 PIK3CD 在 PC 上沒(méi)有顯著的共定位。相比之下，PIK3CA 與 PC 表現(xiàn)出很強(qiáng)的共定位性（圖2 A）。有趣的是，在暴露于循環(huán)機(jī)械拉伸的細(xì)胞中，PC 上 PIK3CA 的強(qiáng)度水平顯著降低（圖2 B）。這些結(jié)果表明，PIK3CA 定位于 PC 上，并在 CMS 處理的 HTM 細(xì)胞中與 PC 解離。

圖2 PIK3CA 在 PC 上的定位及其在CMS 處理的 HTM 細(xì)胞中與 PC 的解離。

上述結(jié)果表明，I 類(lèi) PI3Ks 在 CMS 誘導(dǎo)的自噬中的作用。據(jù)報(bào)道，I 類(lèi) PI3Ks 與 PI 磷酸酶活性相結(jié)合，為 T 細(xì)胞中自噬的啟動(dòng)提供 PI（3）P。因此，研究了由 I 類(lèi) PI3Ks 和 PI 磷酸酶產(chǎn)生的 PI（3）P 是否參與 CMS 誘導(dǎo)的 TM 細(xì)胞自噬。

首先，研究了 I 類(lèi) PI3Ks 參與 PC 的 PI（3）P 產(chǎn)生情況。為此，敲低所有三種 IA 類(lèi) PI3Ks（PIK3CA、PIK3CB 和 PIK3CD）的表達(dá)，并對(duì) PI（3）P 和 PC 標(biāo)志物 ARL13B 進(jìn)行共免疫染色，發(fā)現(xiàn)在 PC 和胞質(zhì)囊泡內(nèi)觀察到 PI（3）P 染色（圖3 A）。正如預(yù)期的那樣，I 類(lèi) PI3K 活性降低的細(xì)胞表現(xiàn)出 PI（3）P 染色的整體降低。定量分析證實(shí)，在 I 類(lèi) PI3K 敲低后，PC 處的 PI（3）P 水平顯著降低，支持 I 類(lèi) PI3Ks 在纖毛 PI（3）P 產(chǎn)生中的作用（圖3 B）。值得注意的是，在機(jī)械拉伸的細(xì)胞中未觀察到 PC 上 PI（3）P 產(chǎn)生的顯著差異。

圖3 PIK3CA、B 和 D 的三重敲低降低了 HTM 細(xì)胞中 PC 上 PI（3）P 的強(qiáng)度。

I 類(lèi) PI3Ks 主要產(chǎn)生 PI（3,4）P2 和 PIP3，然后轉(zhuǎn)化為 PI（3）P。PI（3,4）P2 和 PIP3 都與 AKT 的普列克底物蛋白同源（PH）結(jié)構(gòu)域結(jié)合。為了檢測(cè) PI（3,4）P2 或 PIP3，使用生物傳感器質(zhì)粒AKT-PH-GFP 轉(zhuǎn)染 HTM 細(xì)胞并進(jìn)行 CMS 處理。有趣的是，共聚焦顯微鏡顯示在質(zhì)膜上檢測(cè)到 AKT-PH-GFP 信號(hào)，并在細(xì)胞內(nèi)囊泡中積累（圖4 A）。響應(yīng) CMS 后，每個(gè)細(xì)胞的 AKT-PH-GFP 陽(yáng)性囊泡數(shù)量顯著增加（圖4 A）。共免疫染色進(jìn)一步揭示了這些囊泡與網(wǎng)格蛋白重鏈（CLTC）的部分共定位（圖4 B），表明囊泡是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過(guò)程形成的。

最后，實(shí)驗(yàn)旨在確定 I 類(lèi) PI3K（PIP3 或 PI（3,4）P2）產(chǎn)生的哪些 PIPs 轉(zhuǎn)化為 PI（3）P 以在 CMS 下啟動(dòng)吞噬泡的形成，以及與之相關(guān)的磷酸酶。為此，使用 siRNA 對(duì) SHIP1 和 SHIP2（介導(dǎo) PIP3 轉(zhuǎn)化為 PI（3,4）P2的5’ PI 磷酸酶）或 INPP4A 和 INPP4B（介導(dǎo) PI（3,4）P2 轉(zhuǎn)化為 PI（3）P的 4' PI 磷酸酶）進(jìn)行了雙重敲低，并進(jìn)行 CMS 測(cè)量 LC3 II 水平。結(jié)果顯示，敲低 INPP4A/B ，但不是 SHIP1/2，顯著降低了 TM 細(xì)胞中 CMS 誘導(dǎo)的 LC3 II 增加（圖4 C）。此外，使用 AS1949490 對(duì) SHIP1/2 進(jìn)行化學(xué)抑制，在濃度遞增的情況下，并沒(méi)有降低 CMS 誘導(dǎo)的 LC3 II 水平。共定位研究 AKT-PH-GFP 和 LC3 標(biāo)記點(diǎn)之間的部分共定位或接觸，表明 I 類(lèi) PI3Ks 產(chǎn)生的 PIPs 可能有助于自噬體的生物發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)表明，I 類(lèi) PI3Ks 與 INPP4 磷酸酶一起在 CMS 誘導(dǎo)的TM 細(xì)胞自噬中起直接作用。

圖4 在 HTM 細(xì)胞 CMS 期間 PI（3,4）P2 陽(yáng)性囊泡對(duì)自噬的調(diào)節(jié)。

總之，該研究首次描述了 PIK3CA-INPP4A/B 在機(jī)械應(yīng)力下自噬激活中的作用以及 PIK3CA 在 PC 上的定位。未來(lái)需要進(jìn)一步的研究來(lái)了解哪些 IA 類(lèi) PI3Ks 調(diào)節(jié)自噬降解的機(jī)制，以及通過(guò)機(jī)械力調(diào)節(jié) IA 類(lèi) PI3K 激活的上游信號(hào)。在 TM 機(jī)械感覺(jué)中具有已知功能的強(qiáng)候選者是整合素和 G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）。了解青光眼中的這些通路及其潛在改變，包括 I 類(lèi) PI3K 的改變，可以提供新的治療策略來(lái)恢復(fù) IOP 穩(wěn)態(tài)。

參考文獻(xiàn)：Shim MS, Sim EJ, Betsch K, Desikan V, Su CC, Pastor-Valverde D, Sun Y, Liton PB. Class I PI3Ks activate stretch-induced autophagy in trabecular meshwork cells. Cell Mol Life Sci. 2025 Feb 22;82(1):82. doi: 10.1007/s00018-025-05615-x. PMID: 39985671; PMCID: PMC11846827.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39985671/

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