利用硫辛酸-Ag2S QDs實現(xiàn)NIR-II熒光/光聲成像和腫瘤的化療/光熱治療

本文要點：亞細胞靶向治療近年已成為癌癥治療的重要策略，而線粒體被認為是癌癥治療的潛在靶點。同時硫化銀量子點（Ag2S QDs）在近紅外熒光與光聲成像及光熱治療領域展現(xiàn)出卓越性能。因此，開發(fā)具有線粒體靶向能力的Ag2S QDs具有重要意義。利用硫辛酸（一種參與細胞呼吸的酶促底物）作為配體和線粒體靶向分子的特性，本研究開發(fā)了一種簡易合成水相Ag2S QDs方法。該量子點具有優(yōu)異水溶性和生物相容性，可一步制備并作為線粒體靶向診療一體化材料。通過吸附阿霉素（DOX），研究者成功構建了名為Ag2S-DOX的多功能納米探針。體外與體內(nèi)實驗表明，Ag2S-DOX適用于熒光與光聲雙模成像，并實現(xiàn)線粒體靶向化療-光熱協(xié)同治療，為腫瘤治療提供了創(chuàng)新方案。

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方案1. 線粒體靶向Ag2S-DOX的制備工藝及其在PAI/FI雙模式顯像和腫瘤化療光熱聯(lián)合治療中的應用

本研究通過多種實驗手段首次驗證了一步法制備Ag2S QDs在水溶性、穩(wěn)定性和粒徑均一性方面的可靠性。透射電子顯微鏡（TEM）結果顯示合成的Ag2S QDs具有良好分散性和均一性（圖1A），其平均粒徑約為5.85 nm。高分辨TEM圖像顯示約0.283 nm的晶格間距（圖1B），證實所制備QDs為Ag2S納米晶體。元素分布圖譜顯示納米探針中存在Ag和S元素（圖1C-F），進一步佐證Ag2S QDs的成功合成。C的1s譜圖在284.4、285和288.5 eV處顯示特征峰，分別對應C-C單鍵、C=C雙鍵及C-S鍵（圖1G）。Ag 3d能譜呈現(xiàn)367.8 eV（3d5/2）和373.8 eV（3d3/2）兩個特征峰（圖1H），而S的2p譜圖在161、161.9、162.8和163.3 eV處的四個峰與文獻報道一致（圖1I），確認Ag為+1價態(tài)、S為-2價態(tài)，表明游離硫辛酸（LA）修飾的Ag2S QDs成功制備。該Ag2S QDs在近紅外區(qū)域具有顯著吸收，并于808 nm近紅外光激發(fā)下在1120 nm處產(chǎn)生強烈熒光發(fā)射峰（圖1J），充分展現(xiàn)其在深層組織成像中的應用潛力。

圖1. Ag2S QDs的表征

Ag2S QDs紅外譜圖中2930 cm⁻¹處的羧酸特征峰，證實LA已成功修飾于QDs表面（圖1K）。Ag2S QDs的水合直徑分布在9-16 nm范圍內(nèi)（圖1L），表面電荷為-43.67±0.46 mV，且循環(huán)過程中保持穩(wěn)定（圖1M）。在25℃條件下儲存30天后，其粒徑與Zeta電位仍保持穩(wěn)定，表明QDs具有優(yōu)異穩(wěn)定性（圖1N）。實驗表明，熒光與光聲強度隨QDs濃度增加而增強，證實納米探針具備良好成像性能（圖1O,P）。熒光與光聲信號強度均與濃度呈正相關。

圖2. Ag2S QDs的光熱性能表征

光熱性能測試中，當Ag2S QDs濃度為1 mg/mL時，在1.5 W/cm²激光照射5分鐘后溫度升至61.4℃。相同濃度下，功率密度越高，QDs升溫越顯著（圖2A,B）；而相同功率密度下，溫度升幅隨QDs濃度增加而增大（圖2C,D）。多次激光循環(huán)照射實驗表明Ag2S QDs具有優(yōu)異光熱穩(wěn)定性（圖2E）。經(jīng)計算光熱轉換效率達48.94%。實驗證實所制備的Ag2S QDs具備優(yōu)異光熱性能，可應用于腫瘤光熱治療。

圖3. 1 mg Ag2S量子點對不同質(zhì)量DOX的載藥效率和包封率，n=3

材料往往處于最低能量狀態(tài)。表面能越高，這種趨勢越強。該趨勢使得Ag2S量子點具有強吸附能力。利用Ag2S量子點的高比表面積吸附阿霉素（DOX），形成載藥納米探針（Ag2S-DOX）。將不同質(zhì)量的DOX與1 mg Ag2S量子點加入1 mL PBS溶液中發(fā)現(xiàn)，載藥量隨DOX質(zhì)量增加逐漸升高，而包封效率逐漸降低（圖3A）。Ag2S-DOX的熒光光譜中出現(xiàn)DOX的特征發(fā)射峰，證明DOX已成功負載于Ag2S量子點（圖3B）。定量實驗可為DOX釋放的可控性提供更具說服力的研究結果。當pH=5.4時，72小時內(nèi)的DOX釋放效率達59.03%±1.70%，而pH=7.4條件下僅為12.16%±2.08%（圖3E）。激光照射使DOX釋放速率顯著提升，未輻照時釋放進程則趨于平緩，經(jīng)五次輻照后DOX累計釋放率達52.21%±0.77%（圖3F）。

圖4. Ag2S QDs體外實驗

納米探針的低毒性及良好生物安全性對其臨床應用至關重要。采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度納米探針（0、15.6、31.3、62.5、125、250、500 μg/mL）對細胞生長的影響。當探針濃度達500 μg/mL時，各組細胞存活率仍高于85%（圖4A），表明Ag2S量子點具有低細胞毒性及良好生物相容性。為評估納米探針在血液中的安全性，開展溶血實驗。400 μg/mL Ag2S量子點與紅細胞共孵育8小時后，溶血率仍低于3%（圖4B），表明其適用于體內(nèi)應用。通過檢測細胞中近紅外熒光（NIR FI）及光聲成像（PAI）能力，證實Ag2S量子點為優(yōu)異的造影劑。隨著孵育時間延長，細胞內(nèi)Ag2S量子點數(shù)量顯著增加，NIR熒光及光聲信號逐漸增強（圖4C、4D），表明其可被細胞攝取并通過熒光/光聲成像實時監(jiān)測。采用Calcein AM/PI雙染法可視化觀察Ag2S量子點的光熱治療效果。未加載納米探針的激光輻照細胞呈現(xiàn)綠色熒光，表明細胞活性良好；而加載探針并進行808 nm激光（1.5 W/cm²）輻照10分鐘后，紅色PI染色細胞數(shù)量隨孵育時間增加顯著上升（圖4E），與光聲成像結果一致，證明光熱治療效果與量子點吞噬量正相關。為避免熱耐受并增強療效，聯(lián)合DOX的光熱-化療可更徹底消除腫瘤。細胞死亡率隨探針濃度增加呈梯度上升（圖4F），驗證協(xié)同治療優(yōu)勢。激光輻照后，隨孵育時間延長，DOX逐漸釋放至細胞核（圖4G）。結合圖3B不同探針熒光特征，推測圖4G中紅色熒光較弱是由于未釋放的DOX仍被Ag2S猝滅，僅釋放部分可顯現(xiàn)熒光，驗證近紅外激光可精準調(diào)控細胞內(nèi)DOX釋放。

圖5. Ag2S QDs細胞實驗

通過激光共聚焦掃描顯微鏡成像實驗驗證LA的靶向能力（圖5A）。鑒于Ag2S量子點無法觀測熒光，實驗采用FITC替代表征。FITC-Mal經(jīng)LA修飾后獲得線粒體靶向能力，結果顯示無靶向能力的游離FITC-Mal在細胞中僅呈現(xiàn)微弱綠色熒光，而具有線粒體靶向能力的FITC-LA可進入細胞，其綠色熒光與線粒體特異性染料的紅色熒光幾乎完全重疊（合并后呈黃色），證實LA具有優(yōu)異的線粒體靶向能力。通過透射電鏡觀察細胞超薄切片可清晰看到Ag2S量子點在線粒體中特異性富集（圖5B），紅色方框區(qū)域為線粒體嵴結構，進一步佐證其靶向能力。圖5C、D分別為不同處理后不同細胞的存活率。結果顯示光熱治療聯(lián)合DOX給藥組的細胞存活率最低，證明聯(lián)合治療的高效性。

圖6. Ag2S QDs體內(nèi)成像實驗

當腫瘤體積達80 mm³時啟動體內(nèi)成像及治療實驗。通過尾靜脈注射納米探針后，采用光聲成像（PAI）與熒光成像（FI）系統(tǒng)對小鼠進行動態(tài)評估。體內(nèi)治療實驗的成像結果顯示，Ag2S量子點在腫瘤部位富集水平于注射后約12小時達到峰值，故選擇此時段開展治療并觀察不同處理組小鼠的腫瘤體積、體重及相關體征變化（圖6A）。實驗證實，隨時間推移納米探針在腫瘤部位持續(xù)富集，12小時PA與FI信號強度達到最大值（圖6B、6C），凸顯Ag2S量子點優(yōu)異的成像性能。值得注意的是，24小時后大部分探針已代謝清除，印證其安全性優(yōu)勢。通過尾靜脈向荷瘤BALB/c裸鼠注射不同探針，并依據(jù)PAI/FI結果于12小時后實施治療。熱成像顯示，Ag2S量子點組與Ag2S-DOX組腫瘤溫度顯著高于PBS組及DOX組，證實Ag2S量子點具備優(yōu)良光熱性能（圖6D）。隔日記錄的腫瘤體積顯示：PBS組腫瘤增殖最快，Ag2S量子點組無明顯抑制作用，而DOX組與Ag2S-DOX組可有效延緩腫瘤生長，其中Ag2S-DOX+激光組抑制效果最為顯著，體現(xiàn)協(xié)同治療的優(yōu)越性。結合腫瘤抑制率與生存率分析，光熱-化療聯(lián)合策略展現(xiàn)出更優(yōu)療效。然而，Ag2S量子點+激光組與Ag2S-DOX+激光組仍存在腫瘤復發(fā)（治療14天后復發(fā)率分別為50%與25%），進一步佐證多模式聯(lián)合治療的必要性（圖6F）。

各組小鼠體重在14天內(nèi)無顯著波動（圖6G），提示其良好的生物安全性。通過ICP-MS分析Ag+含量發(fā)現(xiàn)，注射24小時后量子點于腫瘤部位富集量達峰值，雖與成像峰值時間（12小時）存在差異，但治療實驗表明該富集量足以產(chǎn)生顯著療效。此外，血液中量子點的半衰期僅為0.47小時（圖6I），表明其快速代謝特性可降低潛在副作用。綜合結果表明，Ag2S量子點可通過增強滲透滯留效應（EPR效應）實現(xiàn)腫瘤精準成像與治療，同時兼具代謝優(yōu)勢。

本研究在注射后0、0.25、1、3和7天收集小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟以計算器官系數(shù)（圖6J a–e）。結果顯示，實驗組的器官系數(shù)與對照組相比無顯著變化，且均處于正常范圍內(nèi)。在注射納米探針后對小鼠進行血常規(guī)、血液生化分析及主要器官組織學分析。結果顯示，在注射6小時后出現(xiàn)變化，但7天內(nèi)恢復正常（圖6J f–i）。為研究注射對小鼠肝腎功能的影響，對丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、尿素氮（BUN）和堿性磷酸酶（ALP）進行分析。類似地，所有四項指標在注射后輕微波動，但7天內(nèi)恢復至正常水平，表明Ag2S量子點未對小鼠造成顯著損傷（圖6J j–m）。此外，實驗期間小鼠攝食正常，總體體重未出現(xiàn)顯著變化（圖6J n, o）。上述結果均證實納米探針具有低毒性和良好的生物安全性。器官的H&E染色結果顯示，對照組與實驗組在注射后0.25、1、3和7天的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和小腸結構均無顯著變化（圖6K），表明Ag2S量子點對這些器官幾乎無毒性，進一步支持其安全性。

本研究成功制備了新型線粒體靶向Ag2S量子點，其具備優(yōu)異的近紅外熒光（NIR FL）、光聲成像（PAI）及光熱性能。通過負載化療藥物構建的Ag2S-DOX復合物，可實現(xiàn)化療與光熱治療的協(xié)同效應。相較于非靶向藥物遞送體系，線粒體靶向化療藥物在降低正常細胞毒性的同時增強了癌細胞殺傷效果，從而克服耐藥性并提升療效。然而，線粒體靶向的其他優(yōu)勢仍需進一步驗證，例如線粒體損傷引發(fā)的細胞信號通路變化及其作用機制�？傮w而言，本研究開發(fā)的線粒體靶向量子點為腫瘤診療提供了一種具有潛力的新策略。

 

參考文獻

Xuan Y, Su Z, Guan M, et al. Lipoic Acid Capped Ag2S Quantum Dots for Mitochondria-Targeted NIR-II Fluorescence/Photoacoustic Imaging and Chemotherapy/Photothermal Treatment of Tumors[J]. ACS Applied Nano Materials, 2025, 8(8): 3737-3748.

 

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