AVATAR低氧高壓培養(yǎng)：雙重提升CAR-T細(xì)胞增殖與功能，且保持表型穩(wěn)定

目前，關(guān)于大氣壓力升高對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)態(tài)影響的研究較為有限。部分研究表明，在環(huán)境壓力增至2.3 PSI時(shí)，牛內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量及CHO細(xì)胞的蛋白產(chǎn)量有所提升，但這些效應(yīng)存在細(xì)胞類型依賴性，可能促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖。本研究創(chuàng)新性地采用AVATAR Foundry和AVATAR Odyssey培養(yǎng)系統(tǒng)（可精確調(diào)控氧氣、二氧化碳及高壓水平），系統(tǒng)探究了5 PSI高壓與低氧條件聯(lián)合對(duì)人原代T細(xì)胞培養(yǎng)的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在該培養(yǎng)條件下，T細(xì)胞在多種培養(yǎng)容器中的增殖效率顯著提升，同時(shí)細(xì)胞表型始終保持穩(wěn)定。尤為值得注意的是，在CD19 CAR-T與NALM6細(xì)胞共培養(yǎng)的殺傷實(shí)驗(yàn)中，特定低氧培養(yǎng)條件下的CD19 CAR-T細(xì)胞展現(xiàn)出持續(xù)的腫瘤殺傷能力，且在反復(fù)攻擊腫瘤細(xì)胞時(shí)未出現(xiàn)耗竭現(xiàn)象。此外，低氧條件下培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞的GLUT1表達(dá)量顯著上升，這一分子已被證實(shí)與增強(qiáng)抗腫瘤效力、減輕細(xì)胞耗竭以及延長存活期密切相關(guān)。
這一發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞治療產(chǎn)品的規(guī)�；�生產(chǎn)提供了創(chuàng)新解決方案，不僅能夠同時(shí)提升細(xì)胞產(chǎn)量和功能活性，還能確保細(xì)胞特性的穩(wěn)定性，直接響應(yīng)了細(xì)胞基因治療領(lǐng)域?qū)Ω咝�能、�?guī)模化生產(chǎn)的迫切需求。本研究不僅證實(shí)了低氧高壓培養(yǎng)的協(xié)同增效作用，也為優(yōu)化細(xì)胞治療生產(chǎn)工藝提供了重要的理論與實(shí)踐依據(jù)。
 
材料與方法
本研究采用健康供體來源的凍存原始CD3+ T細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。復(fù)蘇后的細(xì)胞使用含10%熱滅活胎牛血清（HI-FBS）的RPMI培養(yǎng)基，并添加人源T細(xì)胞激活劑CD3/28 Dynabeads及重組人IL-2（rhIL-2）進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件設(shè)置為三種：常規(guī)CO₂培養(yǎng)箱（NI）、AVATAR培養(yǎng)系統(tǒng)（AVT）15% O₂+5 PSI和AVATAR培養(yǎng)系統(tǒng)（AVT）10% O₂+5 PSI。
次日，使用第三代CD19-CAR慢病毒或STEAP1-CAR慢病毒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，并將細(xì)胞返回各自的培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)擴(kuò)增，最后進(jìn)行凍存。每2-3天使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增與活力檢測，同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)分析CAR表達(dá)及細(xì)胞表型。采用兩種針對(duì)NALM6-mCHERRY-Luc-Puro靶細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能活性評(píng)估：
• 持續(xù)殺傷實(shí)驗(yàn)：將CAR陽性效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按不同比例長期共培養(yǎng)。使用流式細(xì)胞術(shù)或Axion OMNI活細(xì)胞成像系統(tǒng)測定CAR特異性殺傷活性，參照組為未轉(zhuǎn)導(dǎo)（UTD）對(duì)照組、單純的NALM6靶細(xì)胞組及熒光計(jì)數(shù)微球。此實(shí)驗(yàn)在常規(guī)培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
• 反復(fù)殺傷實(shí)驗(yàn)：按上述方法建立共培養(yǎng)體系，每48-72小時(shí)取樣進(jìn)行流式檢測并補(bǔ)充新鮮的NALM6靶細(xì)胞。每次補(bǔ)充靶細(xì)胞視為新一輪“激發(fā)”，該過程持續(xù)進(jìn)行，直至效應(yīng)細(xì)胞功能衰竭。數(shù)據(jù)通過NALM6細(xì)胞在時(shí)間推移中的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行呈現(xiàn)。
 
AVATAR 培養(yǎng)系統(tǒng)
臨床前及 GMP 級(jí)細(xì)胞治療生產(chǎn)平臺(tái)
AVATAR Odyssey系統(tǒng)通過精確調(diào)控氧氣水平和壓力，能夠篩選理想的環(huán)境條件，從而增強(qiáng)細(xì)胞治療的效力和產(chǎn)量。此外，該系統(tǒng)還可以模擬腫瘤微環(huán)境（TME）等生理?xiàng)l件，為研究提供高度仿真的測試環(huán)境。在確認(rèn)了理想的環(huán)境條件后，將這些條件應(yīng)用于全封閉的AVATAR Foundry系統(tǒng)，該系統(tǒng)符合GMP標(biāo)準(zhǔn)，專用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)。這一無縫銜接確保了從研究到生產(chǎn)的有效性和可靠性，推動(dòng)了細(xì)胞治療領(lǐng)域的進(jìn)步。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 
1. 高壓條件下擴(kuò)增的CD19 CAR-T細(xì)胞顯著提高細(xì)胞產(chǎn)量
本研究對(duì)比了健康供體T細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)箱（NI）和AVATAR Odyssey（AVT）系統(tǒng)中的生長情況：
A. 健康供體T細(xì)胞分別在常規(guī)培養(yǎng)箱（NI）和不同高壓條件下的AVATAR Odyssey系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增（12名健康供體的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差）。B. T細(xì)胞在不同培養(yǎng)容器中分別于常規(guī)培養(yǎng)箱或5 PSI高壓條件下培養(yǎng)7天。
結(jié)果表明，AVT條件下的T細(xì)胞產(chǎn)量顯著高于常規(guī)培養(yǎng)箱。這一發(fā)現(xiàn)為提高CAR-T細(xì)胞的生產(chǎn)效率提供了新的思路，有望在臨床應(yīng)用中提升治療效果。

2. 低氧和高壓條件下培養(yǎng)的T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較常規(guī)培養(yǎng)箱增強(qiáng)或相當(dāng)
健康供體T細(xì)胞的CD19 CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分析：細(xì)胞在激活后第1天使用MOI為3的CD19-CAR慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞分別在常規(guī)培養(yǎng)箱(NI)或AVATAR Odyssey(AVT)系統(tǒng)的透氣袋中培養(yǎng)8天，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CAR表達(dá)水平。A.供體1數(shù)據(jù)，B.供體2數(shù)據(jù)。
數(shù)據(jù)顯示，在AVT培養(yǎng)條件下，T細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與常規(guī)培養(yǎng)條件相比相當(dāng)或有所提高。這一發(fā)現(xiàn)提示低氧和高壓環(huán)境在T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)中的潛在優(yōu)勢，為今后T細(xì)胞治療的研究提供了新的思路。

3. 低氧高壓環(huán)境下培養(yǎng)的T細(xì)胞GLUT1表達(dá)增加而表型保持穩(wěn)定
隨著壓力的增加，細(xì)胞表型變化不顯著，而降低氧濃度則會(huì)顯著影響GLUT1的表達(dá)。
A. 供體樣本分析顯示，CCR7+CD45RA-中央記憶T細(xì)胞和CCR7+CD45RA+初始/干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞的比例較高，但在不同培養(yǎng)條件下未觀察到顯著差異。
B. 經(jīng)STEAP1 CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞在不同低氧條件下培養(yǎng)8天后，可觀察到隨著氧濃度降低，GLUT1高表達(dá)細(xì)胞亞群的出現(xiàn)。
C. 另一供體樣本（STEAP1 CAR-T細(xì)胞，培養(yǎng)袋擴(kuò)增8天）結(jié)果顯示，隨著氧濃度的降低，高表達(dá)GLUT1細(xì)胞亞群的比例顯著增加（高表達(dá)GLUT1細(xì)胞被標(biāo)記為"glut1++"）。圖中展示了不同GLUT1表達(dá)水平細(xì)胞的代表性點(diǎn)陣圖。
數(shù)據(jù)顯示，低氧條件顯著增強(qiáng)T細(xì)胞的GLUT1表達(dá)，而表型亞群的穩(wěn)定性在不同壓力條件下保持相對(duì)不變，這為研究T細(xì)胞在微環(huán)境中的適應(yīng)性提供了重要依據(jù)。

4. 低氧高壓環(huán)境擴(kuò)增的CD19 CAR-T細(xì)胞在持續(xù)殺傷實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出更優(yōu)效力
與常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在低氧高壓條件下培養(yǎng)的細(xì)胞具有更高療效：
A. 在不同條件下擴(kuò)增的CD19 CAR-T細(xì)胞與表達(dá)mCHERRY熒光蛋白的NALM6腫瘤細(xì)胞置于常規(guī)培養(yǎng)箱的96孔板中共培養(yǎng)，5天后通過Axion OMNI系統(tǒng)成像（左圖顯示熒光圖像，右圖通過AxisVue軟件定量mCHERRY覆蓋率），CAR-T:NALM6=1:16。
B. CD19 CAR-T細(xì)胞與NALM6-mCHERRY細(xì)胞按不同效靶比共培養(yǎng)7天，使用流式細(xì)胞儀檢測時(shí)加入熒光計(jì)數(shù)微球，根據(jù)存活NALM6細(xì)胞群計(jì)算殺傷率。
這些研究結(jié)果表明，在低氧高壓環(huán)境中擴(kuò)增的CD19 CAR-T細(xì)胞可能在持續(xù)殺傷實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出更優(yōu)效力，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

5. 低氧高壓環(huán)境擴(kuò)增的CD19 CAR-T細(xì)胞在反復(fù)殺傷實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出持久殺傷活性
低氧高壓培養(yǎng)條件下獲得的CAR-T細(xì)胞在反復(fù)殺傷實(shí)驗(yàn)時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的持久性。供體1和2經(jīng)可溶性CD3/CD28激活劑預(yù)處理1天后，用CD19-CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后進(jìn)行7天擴(kuò)增并冷凍保存。將CAR-T效應(yīng)細(xì)胞與NALM6-mCHERRY靶細(xì)胞按1:2比例于48孔板中置于常規(guī)培養(yǎng)箱共培養(yǎng)。48小時(shí)后取樣，在熒光計(jì)數(shù)微球存在下通過流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)體系中存活NALM6細(xì)胞濃度。補(bǔ)充新鮮NALM6細(xì)胞及培養(yǎng)基后繼續(xù)共培養(yǎng)72小時(shí)再次取樣，該流程循環(huán)進(jìn)行。效應(yīng)細(xì)胞共經(jīng)歷6輪連續(xù)攻擊。

結(jié)果顯示，與常規(guī)培養(yǎng)條件相比，低氧高壓擴(kuò)增組在經(jīng)歷多次攻擊后，仍能有效維持NALM6細(xì)胞濃度的顯著降低。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一次獨(dú)立攻擊實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為雙重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，C1-C6分別代表第1至第6次攻擊。
 
未來計(jì)劃 
本研究的下一步計(jì)劃包括體內(nèi)與實(shí)體瘤建模、優(yōu)化培養(yǎng)條件、細(xì)胞因子分析及RNA測序等多個(gè)環(huán)節(jié)。
研究表明，使用AVATAR Odyssey和AVATAR Foundry系統(tǒng)能夠有效促進(jìn)T細(xì)胞在模擬實(shí)體瘤內(nèi)部環(huán)境條件下的適應(yīng)性培養(yǎng)。這種方法通過在更接近生理環(huán)境的條件下培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，并對(duì)T細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行功能分析，預(yù)示著在動(dòng)物模型及臨床應(yīng)用中有可能獲得更具預(yù)測性的結(jié)果。這些經(jīng)過適應(yīng)性培養(yǎng)的T細(xì)胞能經(jīng)歷代謝轉(zhuǎn)變，從而增強(qiáng)它們?cè)诘脱醐h(huán)境（氧氣濃度較低）中的生存能力。

在本實(shí)驗(yàn)中，T細(xì)胞通過轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向卵巢癌標(biāo)志物（ROR1）的嵌合抗原受體（CAR）進(jìn)行改造，并在3% O₂和4 PSI壓力條件下擴(kuò)增。與此同時(shí)，前列腺癌細(xì)胞系則在1% O₂和2 PSI壓力的腫瘤微環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，CAR-T細(xì)胞需在模擬腫瘤微環(huán)境下對(duì)抗腫瘤細(xì)胞，并每48-72小時(shí)接受新一輪的腫瘤細(xì)胞攻擊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的T細(xì)胞在隨后的攻擊中展現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤生長抑制能力。這一發(fā)現(xiàn)表明，低氧暴露或許能使T細(xì)胞更好地適應(yīng)實(shí)體瘤的惡劣微環(huán)境，從而提升其治療效果。
 
總結(jié)與討論 
本研究通過對(duì)AVATAR系統(tǒng)中低氧與高壓條件下T細(xì)胞的培養(yǎng)，得出以下重要結(jié)論：
1. 在低氧與高壓環(huán)境下，T細(xì)胞的增殖能力得到了適度提升，且隨著壓力的增加，細(xì)胞擴(kuò)增的促進(jìn)作用更為顯著。這表明，培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)整能夠有效影響T細(xì)胞的增殖特性。
2. 受低氧高壓培養(yǎng)條件的影響，T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率表現(xiàn)出個(gè)體差異性。部分供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率得到了提升，而另一些則未見顯著變化，提示需進(jìn)一步探討供體細(xì)胞特性的影響因素。
3. 常見的T細(xì)胞亞群表面標(biāo)志物，這說明低氧高壓條件對(duì)細(xì)胞的基本表型并無明顯干擾。
4. 在低氧條件下培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞中，觀察到GLUT1高表達(dá)的細(xì)胞亞群，其表達(dá)水平顯著高于常規(guī)活化擴(kuò)增的典型值。根據(jù)文獻(xiàn)（Shi 2024）的報(bào)道，GLUT1的過表達(dá)與增強(qiáng)的抗腫瘤效能及代謝適應(yīng)性相關(guān)，提示該現(xiàn)象可能與細(xì)胞改善的功能狀態(tài)密切關(guān)聯(lián)。
5. 在生理相關(guān)條件下培養(yǎng)的CAR-T細(xì)胞，在延長觀察周期及持續(xù)攻擊實(shí)驗(yàn)中，展現(xiàn)出了更強(qiáng)的殺傷效力及持續(xù)的細(xì)胞毒性。這為CAR-T細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用提供了有利依據(jù)，強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)條件優(yōu)化的重要性。
綜上所述，通過對(duì)培養(yǎng)條件的調(diào)整，T細(xì)胞的增殖能力與功能特性均得到了顯著改善，提供了進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞治療策略的潛力。