小鼠膽汁酸分析研究肝膽汁淤積病因

摘要

膽汁是肝臟分泌的一種重要物質(zhì)，它有助于在腸道中消化食物中的脂肪。膽汁酸（BAs）是膽汁的主要有機(jī)溶質(zhì)成分。這些膽汁酸由肝臟中的膽固醇合成，并儲(chǔ)存在膽囊中。當(dāng)膽汁酸分泌到十二指腸區(qū)域后，在遠(yuǎn)端小腸（回腸）中被重新吸收，并通過門靜脈循環(huán)返回肝臟。在腸道中，膽汁酸會(huì)被腸道細(xì)菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶去結(jié)合（即去除甘氨酸或牛磺酸部分）。

膽汁酸被分為兩大類：主要膽汁酸（如膽酸-CA、熊去氧膽酸-CDCA）和次要膽汁酸（如脫氧膽酸-DCA、石膽酸-LCA）。1主要膽汁酸由肝細(xì)胞合成，而次要膽汁酸則是通過腸道細(xì)菌對(duì)主要膽汁酸的代謝作用生成。人肝臟主要合成初級(jí)膽汁酸CA和CDCA，小鼠主要從CDCA合成CA和6-羥基化鼠膽酸（MCA）。3種膽汁酸可進(jìn)一步分為非結(jié)合型和結(jié)合型（如甘氨膽酸-GCA、牛磺膽酸-TLCA）組（結(jié)構(gòu)總結(jié)見圖1）

膽汁酸（BAs）調(diào)控多種重要的生物功能，包括脂質(zhì)和葡萄糖代謝、營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收、體溫調(diào)節(jié)、能量平衡、膽汁酸合成及膽固醇平衡。許多疾病源于膽汁酸失衡，如膽汁酸腹瀉（或吸收不良）、膽汁酸合成障礙以及多種肝內(nèi)膽汁淤積癥。幸運(yùn)的是，膽汁酸療法正逐漸成為治療非酒精性脂肪肝、原發(fā)性膽汁性膽管炎和代謝綜合征（包括高血糖、高甘油三酯血癥、胰島素抵抗和肥胖）的治療選擇。

鑒于膽酸（BAs）在生物和功能上的重要性，其在組織（如肝臟、腸道、糞便）和生物流體（如尿液、血液）中的水平正逐漸被研究作為肝功能、損傷和疾病的潛在生物標(biāo)志物。在這些研究中，通常使用質(zhì)譜（MS）方法結(jié)合相應(yīng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品來量化游離和結(jié)合的膽酸。一種常用的方法是將反相液相色譜（RPLC）與質(zhì)譜儀聯(lián)用，采用負(fù)離子模式下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）或選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。然而，分析技術(shù)的發(fā)展受到了膽酸化學(xué)相似性（異構(gòu)體和等重異構(gòu)體）及其在生物基質(zhì)中濃度范圍廣泛（從納摩爾到毫摩爾）等多方面因素的挑戰(zhàn)。

本文介紹了新開發(fā)的使用CIL膽酸標(biāo)準(zhǔn)混合物的方法，并討論了該方法在肝病研究中的應(yīng)用結(jié)果。該方法解決了先前分析中遇到的一些難題，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)所有16種膽酸目標(biāo)的基線分離。在研究應(yīng)用中，通過使用肌球蛋白Vb（myoVb；基因MYO5B）缺失的動(dòng)物模型，研究了遠(yuǎn)端回腸和肝臟中膽汁酸組成的改變（見圖2）。

MyoVb是一種分子馬達(dá)，負(fù)責(zé)將關(guān)鍵物質(zhì)運(yùn)輸?shù)缴掀ぜ?xì)胞的頂端膜。10個(gè)影響MyoVb功能的突變會(huì)導(dǎo)致人類出現(xiàn)微絨毛包含病（MVID），這種疾病會(huì)引起危及生命的腹瀉。11,12 MVID患者常伴有肝膽汁淤積癥，這是一種由于膽汁流動(dòng)減少或受阻引起的疾病。13,14目前尚不清楚肝膽汁淤積癥和功能性MyoVb缺失時(shí)膽汁酸組成變化的原因，因此本研究旨在通過調(diào)查這些因素來增進(jìn)對(duì)這一機(jī)制的理解。

材料與方法

化學(xué)品與試劑

所有試劑均為最高可用等級(jí)，溶劑為LC-MS級(jí)。在儲(chǔ)存這些化學(xué)品和試劑時(shí)，遵循制造商的建議。CIL的穩(wěn)定同位素標(biāo)記膽酸混合物（未結(jié)合型，貨號(hào)MSK-BA1；結(jié)合型，貨號(hào)MSK-BA2)用作內(nèi)標(biāo)（IS）。CIL的未標(biāo)記膽酸混合物（未結(jié)合型，貨號(hào)MSK-BA1-US；結(jié)合型，貨號(hào)MSK-BA2-US)用作真實(shí)參考材料。這些混合物用于特定化合物的質(zhì)譜儀優(yōu)化及校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的制備。所有混合物均在-80°C（避光）下以純品和溶液形式儲(chǔ)存，直至使用。

溶液制備：將干燥的D-標(biāo)記BA IS混合物分別溶解于1毫升甲醇與水(1：1，體積比）中，隨后進(jìn)行幾分鐘的渦旋混合。這樣可以得到濃度~100微摩爾的IS儲(chǔ)備液。接著，將每份IS儲(chǔ)備液的等分試樣稀釋至250納摩爾，置于含有50毫升甲醇與水(1：1，體積比）的單個(gè)玻璃瓶中。這種IS工作溶液被標(biāo)記為溶液A，并用于生物樣品提取物的制備。另一種IS工作溶液，稱為溶液B（用于中間和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的制備），通過將9毫升溶液A與1毫升甲醇與水(1：1，體積比）在玻璃瓶中稀釋制備，其濃度為225納摩爾。
類似于D標(biāo)記的BA IS溶液制備方法，每個(gè)未標(biāo)記的BA混合物分別溶解在1毫升甲醇與水(1：1，體積比）的混合液中，隨后進(jìn)行幾分鐘的渦旋混合。這樣可以得到濃度~100微摩爾的清晰分析物儲(chǔ)備溶液。通過將每種未標(biāo)記分析物儲(chǔ)備溶液的0.1毫升稀釋到含有0.8毫升溶液B的玻璃瓶中，并進(jìn)行短暫的渦旋混合，制備了濃度為10微摩爾的中間溶液。溶液B作為制備校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋劑（見表1）。

小鼠MVID模型用于研究肝膽汁淤積。最近，研究人員開發(fā)并研究了缺乏myoVb的生殖系小鼠（KO小鼠），以了解myoVb缺失對(duì)腸上皮的影響。新生的生殖系myoVb KO小鼠表現(xiàn)出多種腸道異常，包括細(xì)胞內(nèi)微絨毛內(nèi)含物、絨毛融合、過度增殖、極性蛋白變化和頂端轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷。此外，這些小鼠的生長速度比同窩對(duì)照小鼠慢，并且大約在出生后3-7天因脫水而死亡。盡管腸道在myoVb KO小鼠中已得到充分研究，但肝臟生理變化尚未被記錄，盡管新的研究表明myoVb突變與肝膽汁淤積有關(guān)。我們使用之前描述的myoVb KO小鼠來研究myoVb缺失對(duì)肝臟和腸道膽汁酸調(diào)節(jié)的影響。我們的數(shù)據(jù)表明，生殖系myoVb KO小鼠不僅可能作為人類疾病腸道模型，也可能作為肝膽汁淤積的肝臟模型。
組織收集與均質(zhì)化
新生小鼠（每組3只，包括敲除組和對(duì)照組）在年齡較小的情況下，通過二氧化碳安樂死并隨后斷頭。此程序遵循了MUSC批準(zhǔn)的IACUC協(xié)議（編號(hào)#2021-01252）。在小鼠腹部切開后，取出肝臟和回腸。每個(gè)組織樣本的質(zhì)量被稱重，并放入含有0.1克1.4毫米陶瓷珠（MP Biomedical產(chǎn)品編號(hào)116540434）的組織均質(zhì)化管中。向每個(gè)含有組織樣本的試管中加入等同于200 mg/mL組織密度的冰凍甲醇。使用BeadBug組織均質(zhì)器（或類似設(shè)備）在4 m/s下進(jìn)行兩次均質(zhì)化處理，每次20秒。均質(zhì)后的組織碎片通過在室溫下以16,000×g離心5分鐘來沉淀，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新的2.0 mL冷凍管中。這些樣本在-80°C下保存，直至進(jìn)行LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS樣品制備
在分析時(shí)，將組織樣本從-80°C的冷凍環(huán)境中取出，并在實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面上逐漸升溫至室溫。使用300微升的玻璃自動(dòng)進(jìn)樣器HPLC容器(13毫米內(nèi)徑，帶微插件；賽默飛世爾科技），將每份甲醇化、均質(zhì)化的組織樣本10微升的體積稀釋在90微升的溶液A（即標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物）中。隨后，蓋上自動(dòng)進(jìn)樣器瓶蓋，并進(jìn)行短暫的渦旋混合。此外，還放置了條件標(biāo)準(zhǔn)品(Cond Cal A，所有BAs的濃度為2.44納摩爾）、試劑空白（RBlk）樣品（即溶劑）、空白內(nèi)標(biāo)物樣品(Blk-IS，濃度為0納摩爾校準(zhǔn)物）、校準(zhǔn)物（每個(gè)A至F水平n=3次注射，例如Cal A），以及混合質(zhì)量控制（QC）標(biāo)準(zhǔn)品（例如，用于混合回腸QC的pooled IlQC）。Shimadzu Nexera SIL-30ACMP自動(dòng)進(jìn)樣器配備了1.5毫升聚丙烯瓶架（每個(gè)瓶架有54個(gè)瓶位），以容納上述指定的玻璃自動(dòng)進(jìn)樣器容器。所有樣品均在柱上注入15微升，進(jìn)行LC-MS/MS分析。
RPLC系統(tǒng)條件和梯度程序
BAs的LC分離在Raptor C18柱（100×2.1 mm內(nèi)徑，2.7μm；Restek）和Ultra C18保護(hù)柱（10 x 2.1 mm內(nèi)徑，5μm；Restek）上進(jìn)行。在整個(gè)運(yùn)行過程中，柱和樣品盤分別保持在50°C和4°C。在15微升的柱上注射后，分析物在17分鐘的梯度（見表2）中以0.3毫升/分鐘的流速分離。流動(dòng)相的組成如下：
洗脫液A：10 mM甲酸銨水溶液；洗脫液B：乙腈

MS/MS描述及采集方法參數(shù)​
LC-MS/MS平臺(tái)由一臺(tái)Shimadzu（日本京都）的Nexera-XR MP UHPLC系統(tǒng)和一臺(tái)SCIEX（美國馬薩諸塞州弗雷明漢）的QTRAP®6500質(zhì)譜儀組成，使用上述描述的保護(hù)柱和分析柱。TurboIonSpray®（電噴霧電離源）探針安裝在IonDrive™Turbo V離子源中，該離子源以負(fù)離子模式運(yùn)行。表3列出了本方法中使用的全局MS儀器參數(shù)，而表4則列出了穩(wěn)定同位素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的預(yù)定MRM（單分子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）采集的分子特異性參數(shù)。除非另有說明，分子特異性參數(shù)是通過注入純BA溶液（濃度為1微克/毫升，甲醇：水1：1，體積比）來經(jīng)驗(yàn)性調(diào)整的。對(duì)于標(biāo)記和未標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)BA監(jiān)測(cè)兩個(gè)躍遷，總計(jì)64個(gè)MRM躍遷。由于實(shí)施了sMRM掃描，每個(gè)MRM躍遷的占空比和駐留時(shí)間是動(dòng)態(tài)的，并由采集軟件（Analyst®，版本1.6.2；SCIEX)控制。
分析數(shù)據(jù)
LC-MS/MS系統(tǒng)的操作控制使用了Analyst®（版本1.6.2)，數(shù)據(jù)分析則在MultiQuant™（版本3.0.1；SCIEX)和Microsoft Excel中完成。在結(jié)果解釋前，通過手動(dòng)檢查目標(biāo)BAs的峰選擇和積分來驗(yàn)證。對(duì)于所有16種BAs，構(gòu)建了無基質(zhì)的校準(zhǔn)曲線（從A點(diǎn)2.44 nM到F點(diǎn)2.5µM，每個(gè)點(diǎn)有3次注射），校準(zhǔn)曲線采用1/x加權(quán)因子，通過繪制每個(gè)校準(zhǔn)物的測(cè)量響應(yīng)比（未標(biāo)記/標(biāo)記）與制備濃度的關(guān)系圖來構(gòu)建。BA內(nèi)標(biāo)用于標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)源性BA化合物，樣品提取物中均質(zhì)組織的質(zhì)量被納入濃度測(cè)定計(jì)算中。BA的濃度以每克勻漿組織中的納米摩爾數(shù)表示。在生成熱圖之前，每個(gè)BA的標(biāo)準(zhǔn)化組織濃度在所有樣本中進(jìn)行了十分位數(shù)縮放。具體來說，最低和最高的濃度值分別被設(shè)定為0和1，而中間的每個(gè)值則根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行縮放。熱圖是使用開源數(shù)據(jù)分析和可視化軟件包Orange（版本3.29.1)生成的。
結(jié)果和討論方法
開發(fā)和BA定量
針對(duì)16種目標(biāo)BAs的sMRM躍遷，其分子特異性參數(shù)在QTRAP 6500上通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。對(duì)于非等重BAs（如CA、DCA、LCA、TCA、TLCA、GCA和GLCA)，通過將含有所有BAs的混合中間溶液以1µg/mL的濃度注入甲醇-水（1：1，v/v）中進(jìn)行10倍稀釋來實(shí)現(xiàn)優(yōu)化。對(duì)于具有共同前體和/或產(chǎn)物離子的等重BAs，使用單獨(dú)調(diào)諧溶液進(jìn)行優(yōu)化，這些溶液以1µg/mL的濃度制備，溶劑為1：1的甲醇-水（分別對(duì)應(yīng)β-MCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-10626；CDCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-6780；UDCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-9574；TCDCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-9562；TUDCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-9882；TDCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-9568；GCDCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-7804；GUDCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-9558；GDCA、CIL產(chǎn)品編號(hào)DLM-9554)。通過輕微調(diào)整先前優(yōu)化的梯度程序，我們的最終方法能夠提供所有BAs的基線分辨率。例如，可以觀察到等重TUDCA、TCDCA和TDCA BAs（見圖4）以及GUDCA、GCDCA和GDCA（見圖5）的基線分離。

這些批次中包含了系統(tǒng)適用性、殘留量和合并的質(zhì)控測(cè)量（質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)未顯示）。這些措施旨在評(píng)估方法性能。系統(tǒng)適用性測(cè)試通過三次注射最低校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品（Cal A；2.44 nM，用于BAs）進(jìn)行。隨后，對(duì)三次Cal A注射中測(cè)量到的每個(gè)BAs峰進(jìn)行了積分，并計(jì)算了精度（%CV）。表5展示了我們典型的系統(tǒng)適用性精度結(jié)果。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的高精密度為分析系統(tǒng)適用于實(shí)驗(yàn)樣品分析提供了信心。
在殘留評(píng)估中，計(jì)算了序列批次中未標(biāo)記和D-標(biāo)記BA響應(yīng)（峰面積）的比例，這些響應(yīng)是在第三次Cal H（所有BAs均為2,500 nM）后注入的空白樣品中測(cè)得的，與三次Cal A注射中的平均未標(biāo)記和D-標(biāo)記BA響應(yīng)相比。殘留以百分比形式表示，未標(biāo)記BAs的典型殘留結(jié)果見表6，D-標(biāo)記BA IS化合物的殘留結(jié)果見表7。
研究結(jié)果
顯示，未標(biāo)記的BA分析物和D-標(biāo)記的IS化合物的殘留量幾乎可以忽略不計(jì)，其精度甚至達(dá)到了FDA-GLP的要求（即，未標(biāo)記分析物的殘留量低于20%，IS化合物的殘留量低于5%）。這進(jìn)一步證明了所開發(fā)方法的有效性和分析平臺(tái)的可靠性。
研究結(jié)果表明，體內(nèi)肌動(dòng)蛋白Vβ（myoVb）的缺失會(huì)導(dǎo)致多種腸道功能障礙。然而，肌動(dòng)蛋白Vβ在其他器官系統(tǒng)中的作用及其對(duì)膽汁酸（BAs）調(diào)節(jié)的影響尚不明確。我們測(cè)量了同窩對(duì)照組和肌動(dòng)蛋白Vβ基因敲除小鼠的膽汁酸組成，以確定這些變化是否由遠(yuǎn)端腸道和肝臟中肌動(dòng)蛋白Vβ功能喪失引起。
種系myoVb KO小鼠的肝臟中CA、DCA、β-MCA、GCA、TUDCA、TCDCA和TCA水平顯著降低（見圖8）
這些數(shù)據(jù)表明，myoVb的缺失可能影響B(tài)A信號(hào)傳導(dǎo)或BA的組裝。在回腸中測(cè)量BA時(shí)發(fā)現(xiàn)，與同窩對(duì)照組相比，myoVb基因敲除小鼠的CA和β-MCA水平顯著升高（見圖9）。

這表明，myoVb的缺失可能會(huì)阻止BAs從腸細(xì)胞正確運(yùn)輸?shù)礁窝�環(huán)，從而將BAs送回肝臟進(jìn)行循環(huán)。
總體而言，同窩對(duì)照組與myoVb基因敲除小鼠之間膽汁酸（BAs）組成的差異表明，myoVb的缺失影響了肝臟和腸道中膽汁酸的正常生成和循環(huán)。此外，這也提示myoVb可能在肝臟和腸道中調(diào)節(jié)膽汁酸信號(hào)通路（即FXR途徑）。
結(jié)論和展望
開發(fā)的LC-MRM/MS方法提供了一種新的手段，能夠以高通量的方式基線分離多種膽汁酸（BAs），其中一些膽汁酸具有同量異位物。在實(shí)際應(yīng)用中，該方法揭示了關(guān)于體內(nèi)肌球蛋白Vb丟失的幾個(gè)有趣發(fā)現(xiàn)。結(jié)果顯示，肝臟中的CA、DCA、β-MCA、GCA、TUDCA、TCDCA和TCA顯著減少。值得注意的是，在肌球蛋白Vb敲除的小鼠中，回腸組織中的CA和β-MCA含量高于同窩對(duì)照組。這些數(shù)據(jù)表明，小鼠肝臟和胃腸道組織樣本中膽汁酸的測(cè)量結(jié)果，提示功能性肌球蛋白Vb的缺失可能影響了肝臟膽汁酸的產(chǎn)生或分泌。下一步，我們將分析缺乏肝細(xì)胞肌球蛋白Vb的成年小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的膽汁酸組合。我們還計(jì)劃將此方法擴(kuò)展到新生兒和成年小鼠的膽汁淤積性肝病模型中，以測(cè)量循環(huán)膽汁酸的水平�？偟膩碚f，能夠準(zhǔn)確測(cè)量實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袀�(gè)別膽汁酸的方法，如本研究所開發(fā)的方法，是深入了解復(fù)雜膽汁酸作用機(jī)制的關(guān)鍵工具。