酶標(biāo)儀上細(xì)菌代謝的微生物學(xué)應(yīng)用

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，酶標(biāo)儀是一種應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)室儀細(xì)菌代謝涵蓋了一組復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)，這些化學(xué)反應(yīng)維系著細(xì)菌的生命活動(dòng)。在微生物學(xué)領(lǐng)域，許多應(yīng)用都依賴于對(duì)酶促反應(yīng)的監(jiān)測(cè)，或?qū)μ囟ù�謝物、酶濃度以及生命分子過(guò)程中所涉及的化學(xué)反應(yīng)的測(cè)量。這些應(yīng)用在基礎(chǔ)研究、環(huán)境研究、生物技術(shù)的不同領(lǐng)域，甚至是藥物開(kāi)發(fā)等方面都具有重要價(jià)值。

本文探討了細(xì)菌代謝的范圍、其對(duì)研究人員的意義，以及如何利用酶標(biāo)儀進(jìn)行多種代謝應(yīng)用的測(cè)定。

1 什么是細(xì)菌代謝？

細(xì)胞從環(huán)境中提取能量，并通過(guò)高度整合的化學(xué)反應(yīng)和相互作用網(wǎng)絡(luò)將較小的分子轉(zhuǎn)化為細(xì)胞成分，這一過(guò)程被稱為代謝。代謝的基本策略是形成能量和大型分子前體。細(xì)菌代謝指的是在這些生物體內(nèi)發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)。

合成代謝和分解代謝

代謝反應(yīng)可分為合成代謝（anabolic pathways）和分解代謝（catabolic pathways）（圖1）。合成代謝指從簡(jiǎn)單分子合成復(fù)雜分子的過(guò)程，需要能量輸入。分解代謝則是將碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等復(fù)雜分子分解為更簡(jiǎn)單的物質(zhì)（如葡萄糖和氨基酸），并在此過(guò)程中釋放能量，以驅(qū)動(dòng)合成代謝過(guò)程。

圖1：分解代謝和合成代謝反應(yīng)

細(xì)菌種類繁多，并進(jìn)化出了多種代謝途徑，使其能適應(yīng)各種環(huán)境。其中一些細(xì)菌可以根據(jù)環(huán)境條件在不同的代謝途徑之間切換，而另一些細(xì)菌則高度專一，適應(yīng)特定且通常要求極為苛刻的環(huán)境。

在細(xì)菌中，一些常見(jiàn)且重要的代謝途徑包括糖酵解（將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸）、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)，涉及碳水化合物、脂肪酸和氨基酸的乙酰輔酶A氧化）、不同類型的發(fā)酵、卡爾文循環(huán)（光合作用的一部分，從二氧化碳合成葡萄糖），以及固氮作用（將分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨）（圖2）。

圖2：細(xì)菌生理的化學(xué)反應(yīng)、代謝過(guò)程及代謝途徑的簡(jiǎn)化示意圖

微生物代謝類型

細(xì)菌代謝能力涵蓋有氧呼吸、厭氧呼吸、發(fā)酵、光合作用，或通過(guò)氧化無(wú)機(jī)分子（如氨或硫化.氫）獲取能量的代謝方式。根據(jù)其代謝途徑的不同，微生物可分為不同的代謝類型。例如，異養(yǎng)微生物（heterotrophic microbes）無(wú)法自行合成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而是依賴有機(jī)碳來(lái)源獲取能量；自養(yǎng)微生物（autotrophic microbes）則可以利用無(wú)機(jī)能源（如二氧化碳）合成糖類等儲(chǔ)能物質(zhì)。光無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)生物（photolithotrophs）通過(guò)氧化無(wú)機(jī)基質(zhì)獲取能量，與光有機(jī)營(yíng)養(yǎng)生物（photoorganotrophs）相似，但其氫供體來(lái)源不同。

表1：不同類型的微生物及其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源

2 為什么要測(cè)量細(xì)菌代謝？

測(cè)量細(xì)菌代謝可幫助研究人員掌握多種生物過(guò)程，并廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。它們可以為優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程提供工業(yè)用途，例如用于生產(chǎn)抗生素、酶和燃料的發(fā)酵過(guò)程。僅抗微生物藥物耐藥性這一項(xiàng)，就極大地推動(dòng)了通過(guò)了解細(xì)菌代謝和細(xì)菌生長(zhǎng)來(lái)開(kāi)發(fā)新型藥物的新方法。此外，代謝研究對(duì)于藥物開(kāi)發(fā)及疾病機(jī)制研究也具有重要意義。

3 酶標(biāo)儀在細(xì)菌代謝研究中的應(yīng)用

研究細(xì)菌代謝的方法多種多樣，以下是幾種常見(jiàn)的實(shí)際應(yīng)用，研究人員可直接使用或加以改進(jìn)。

每條代謝途徑的核心是活性酶及其底物轉(zhuǎn)化，因此，酶活性可作為細(xì)菌代謝的良好檢測(cè)指標(biāo)。例如，在應(yīng)用報(bào)告《通過(guò)熒光檢測(cè)法監(jiān)測(cè)賴氨酸去乙�；�酶活性》中，研究人員使用CycLex SIRT1試劑盒測(cè)定大腸桿菌賴氨酸去乙�；�酶CobB的動(dòng)力學(xué)特性（圖3）。

圖4：大腸桿菌CobB酶動(dòng)力學(xué)特性測(cè)定

細(xì)菌代謝的另一個(gè)重要因素是氧化還原酶。NADH/NAD+和NADPH/NADP+是代謝過(guò)程的許多氧化還原酶使用的輔助因子，能夠監(jiān)測(cè)它們的還原情況，從而提供一種可靠的方法來(lái)測(cè)量它們的活性。在應(yīng)用說(shuō)明《ELISA檢測(cè)和NADH/NADPH轉(zhuǎn)換檢測(cè)》中，BMG LABTECH檢測(cè)儀的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在快速測(cè)定氧化和還原煙酰胺輔因子方面的能力得到了強(qiáng)調(diào)（圖5）。NAD+還原為NADH和NADP+還原為NADPH的過(guò)程可在340 nm處進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

圖7：MycoAlert™反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，其中藍(lán)色代表無(wú)支原體的樣品，紅色代表支原體陽(yáng)性的樣品

氧含量和pH值是細(xì)菌代謝的重要參數(shù)。它們直接影響代謝途徑和特定酶的活性，并可能影響細(xì)菌的生長(zhǎng)。測(cè)量氧含量和pH值有助于研究人員更好地控制細(xì)菌過(guò)程。開(kāi)放流動(dòng)呼吸測(cè)定法是一種生理相關(guān)方法，可用于測(cè)量細(xì)胞呼吸。在應(yīng)用報(bào)告《通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞外酸化與耗氧量來(lái)測(cè)量細(xì)胞代謝變化》中，該系統(tǒng)被轉(zhuǎn)換為96孔微孔板格式，從而能夠在生理相關(guān)大氣條件下實(shí)時(shí)測(cè)量氧和pH水平。該系統(tǒng)是在配備有大氣控制單元的CLARIOstar®酶標(biāo)儀上開(kāi)發(fā)的（圖8）。該系統(tǒng)在人類細(xì)胞中使用時(shí)，可以輕松地用于細(xì)菌。

圖8：在10%氧氣環(huán)境中的耗氧量。含有HepG2細(xì)胞的重復(fù)孔用抗.霉.素.A處理

酶標(biāo)儀具有與細(xì)菌代謝研究特別相關(guān)的功能。這些功能包括將細(xì)菌保持在最佳生長(zhǎng)條件下的大氣控制單元和振蕩選項(xiàng)，以及無(wú)需人工干預(yù)即可可靠探測(cè)各種濃度和信號(hào)強(qiáng)度的樣本的動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)展技術(shù)。

使用96孔、384孔或1536孔微孔板可同時(shí)處理多個(gè)樣品。實(shí)時(shí)測(cè)量適用于繪制細(xì)菌代謝中可能發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化。例如，這適用于細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和酶活性的變化。

酶標(biāo)儀還能夠在各種條件下使用不同的檢測(cè)模式進(jìn)行并行測(cè)量。因此，多功能酶標(biāo)儀在細(xì)菌代謝的常規(guī)和高級(jí)測(cè)量中具有速度、可再現(xiàn)性和規(guī)模方面的優(yōu)勢(shì)。

4 細(xì)菌代謝應(yīng)用的未來(lái)發(fā)展

我們對(duì)細(xì)菌代謝的了解仍在不斷增長(zhǎng)。因此，隨著全球?qū)嶒?yàn)室不斷涌現(xiàn)新的發(fā)現(xiàn)、技術(shù)和應(yīng)用，未來(lái)幾年對(duì)細(xì)菌代謝測(cè)量的需求將繼續(xù)增長(zhǎng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和特定檢測(cè)方法的創(chuàng)新應(yīng)成為未來(lái)發(fā)展的強(qiáng)大催化劑。
 

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