觸珠蛋白 / 結(jié)合珠蛋白（HPT-Ag）的全面解析：結(jié)構(gòu)、制備與免疫特性

一、HPT 的分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能

觸珠蛋白（Haptoglobin, HPT），又稱結(jié)合珠蛋白，是一種由肝臟合成的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，主要功能是結(jié)合游離血紅蛋白（Hb），防止腎臟損傷并回收鐵離子。其關(guān)鍵特征包括：

分子量：約 85-100 kDa（因基因型差異而異）；

結(jié)構(gòu)：由 α 鏈（α1 或 α2）和 β 鏈通過(guò)二硫鍵連接形成四聚體，人類中主要存在三種表型：

HPT 1-1 型：α1 鏈（α1⁰，分子量約 16 kDa）與 β 鏈（27 kDa）組成（α1β）₂；

HPT 2-1 型：α1 鏈與 α2 鏈（α2，分子量約 32 kDa）混合組成（α1α2β₂）多聚體；

HPT 2-2 型：僅含 α2 鏈，形成（α2β）₂多聚體；

基因定位：α 鏈基因（HP1 和 HP2）位于染色體 16q22.1，β 鏈基因（HPB）與 α 鏈連鎖。
 

二、HPT 抗原的制備方法

（一）天然提取法（從人血清）

原料預(yù)處理：

采集新鮮人血清（EDTA 抗凝），56℃滅活 30 分鐘以破壞補(bǔ)體，4℃離心（3000×g，10 分鐘）去除沉淀。

純化流程：

硫酸銨沉淀：血清中加入 40% 飽和度硫酸銨，4℃靜置 2 小時(shí)，離心（10000×g，20 分鐘）收集沉淀，用 PBS（pH 7.4）溶解；

親和層析：通過(guò)血紅蛋白 - 瓊脂糖柱（Hb-Sepharose）純化，利用 HPT 與 Hb 的高親和力（KD≈10⁻⁹ M），用 0.1 M NaCl 洗脫結(jié)合的 HPT；

凝膠過(guò)濾：經(jīng) Sephadex G-200 層析去除雜蛋白，收集分子量 85-100 kDa 的洗脫峰，超濾濃縮至 1-5 mg/mL。

關(guān)鍵參數(shù)：

得率：每升血清約提取 50-100 mg HPT，純度 > 90%（SDS-PAGE 驗(yàn)證）；

活性保留：天然 HPT 需避免極端 pH（<5.0 或> 9.0）和高溫（>50℃），以防 Hb 結(jié)合位點(diǎn)變性。

（二）重組表達(dá)法（基因工程技術(shù)）

表達(dá)系統(tǒng)選擇：

哺乳動(dòng)物細(xì)胞（CHO 細(xì)胞）：可實(shí)現(xiàn)糖基化修飾，更接近天然 HPT 構(gòu)象，推薦表達(dá) α1β 或 α2β 單體；

載體構(gòu)建：克隆 α 鏈和 β 鏈基因（含信號(hào)肽），插入雙順?lè)醋虞d體（如 pIRES），共轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞；

純化步驟：Protein A 親和層析（若融合 IgG Fc 標(biāo)簽）→離子交換層析（Q-Sepharose）→疏水層析（Phenyl-Sepharose）。

表達(dá)效率：

懸浮培養(yǎng) CHO 細(xì)胞表達(dá)量約 10-20 mg/L，純度 > 95%，需通過(guò) Western blot 驗(yàn)證 α/β 鏈組裝。
 

三、HPT 抗原的偶聯(lián)與免疫原性

載體蛋白偶聯(lián)（用于抗體生產(chǎn)）：

偶聯(lián)方法：

EDC/NHS 法：適用于 HPT 羧基與 BSA/OVA 氨基交聯(lián)，優(yōu)化條件為 HPT:BSA（1:5，mg/mg），EDC 濃度 5 mM，室溫反應(yīng) 2 小時(shí)；

戊二醛法：雙功能交聯(lián)劑，需控制戊二醛濃度（0.1-0.5%），避免過(guò)度交聯(lián)導(dǎo)致抗原表位遮蔽；

偶聯(lián)比測(cè)定：

紫外分光法：計(jì)算 280 nm 處 HPT（ε=1.4 mL/mg・cm）與 BSA（ε=0.66 mL/mg・cm）的吸光度，理想分子比為 3-5:1；

SDS-PAGE 遷移率偏移：偶聯(lián)物分子量應(yīng) > 150 kDa（BSA 分子量 66 kDa，HPT 約 90 kDa）。

抗原表位分析：

主要免疫原性區(qū)域位于 α 鏈 N 端（氨基酸 1-50）和 β 鏈 C 端（氨基酸 200-250），其中 α2 鏈特有的重復(fù)序列（如 Pro-Pro-Val-Leu）為 HPT 2-2 型特異性表位；

天然 HPT 的糖基化（N - 糖基化位點(diǎn)位于 α 鏈 Asn38 和 β 鏈 Asn154）可增強(qiáng)抗體識(shí)別效率。
 

四、HPT 的電泳特性與生化參數(shù)

SDS-PAGE 分析：

還原條件下：α1 鏈（16 kDa）、α2 鏈（32 kDa）和 β 鏈（27 kDa）分離；

非還原條件下：形成（αβ）₂四聚體（85 kDa）或（α2β）₂多聚體（100 kDa），HPT 2-1 型可見(jiàn)多條分子量介于 85-100 kDa 的條帶（混合多聚體）。

等電聚焦（IEF）：

pI 約 4.5-5.5（因糖基化程度而異），酸性蛋白，電泳時(shí)向陽(yáng)極遷移，可與堿性蛋白（如白蛋白 pI 4.7）區(qū)分。

功能活性檢測(cè)：

Hb 結(jié)合能力：ELISA 法測(cè)定 HPT 與 Hb 的結(jié)合活性，飽和結(jié)合量為 1 mg HPT 結(jié)合 0.8 mg Hb，KD 值≈5×10⁻¹⁰ M；

溶血抑制實(shí)驗(yàn)：體外測(cè)定 HPT-Hb 復(fù)合物對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用，50% 溶血抑制濃度（IC₅₀）約 10-20 μg/mL。
 

五、HPT 的臨床檢測(cè)與應(yīng)用參數(shù)

作為急性時(shí)相標(biāo)志物：

血清正常參考范圍：成人 0.5-2.0 g/L（不同表型略有差異），兒童 0.3-1.5 g/L；

病理升高：感染、創(chuàng)傷、腫瘤時(shí)可升高 2-5 倍，半衰期約 3-5 天；

病理降低：溶血性貧血（HPT 與游離 Hb 結(jié)合消耗）、肝�。ê铣蓽p少）、先天性 HPT 缺乏癥（罕見(jiàn)，發(fā)病率約 1/10 萬(wàn)）。

檢測(cè)方法學(xué)：

免疫比濁法：自動(dòng)化生化分析儀（如 Roche Cobas c701），檢測(cè)范圍 0.1-5.0 g/L，批內(nèi) CV<5%；

ELISA：雙抗體夾心法（包被抗 α 鏈單抗，檢測(cè)抗 β 鏈多抗），靈敏度 < 10 mg/L，適用于低濃度樣本（如尿液）；

基因型檢測(cè)：PCR-RFLP 法區(qū)分 HP1 和 HP2 基因，HPT 2-2 型與糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

臨床應(yīng)用場(chǎng)景：

溶血性疾病鑒別：血清 HPT 降低伴游離 Hb 升高提示血管內(nèi)溶血（如瘧疾、輸血反應(yīng)）；

肝病評(píng)估：慢性肝炎或肝硬化時(shí) HPT 合成下降，與肝損傷程度正相關(guān)；

炎癥監(jiān)測(cè)：動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) HPT 水平可評(píng)估感染性疾病（如膿毒癥）的預(yù)后。
 

六、HPT 與其他溶血標(biāo)志物的對(duì)比

標(biāo)志物 檢測(cè)樣本 臨床優(yōu)勢(shì) 局限性

HPT 血清 / 血漿 特異性結(jié)合 Hb，反映血管內(nèi)溶血 受肝臟合成影響

游離 Hb 血漿 直接反映溶血程度 半衰期短（<1 小時(shí)）

乳酸脫氫酶（LDH） 血清 非特異性溶血指標(biāo)，普及性高 多種組織損傷均可升高
 

七、HPT 的生物學(xué)功能延伸

抗氧化與抗炎作用：

HPT-Hb 復(fù)合物可清除游離血紅素介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，減少羥基自由基生成；

抑制中性粒細(xì)胞活化，下調(diào)炎癥因子（如 TNF-α、IL-6）釋放。

鐵代謝調(diào)控：

結(jié)合 Hb 后被肝巨噬細(xì)胞（Kupffer 細(xì)胞）通過(guò) CD163 受體內(nèi)吞，促進(jìn)鐵回收（每分子 HPT-Hb 復(fù)合物可回收 4 個(gè) Fe²⁺）；

與鐵調(diào)素（Hepcidin）協(xié)同調(diào)節(jié)血清鐵水平，在貧血伴炎癥時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。
 

八、總結(jié)

觸珠蛋白作為急性時(shí)相蛋白，其抗原制備以天然提取為主，重組表達(dá)需關(guān)注 α/β 鏈的正確組裝。電泳特性可用于表型分析，而免疫比濁法是臨床檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。HPT 在溶血與炎癥疾病中的雙重角色，使其成為連接血液學(xué)與肝病學(xué)的重要生物標(biāo)志物，未來(lái)基于 HPT-Hb-CD163 通路的治療策略可能為溶血性疾病提供新方向。