抗豬藍耳病毒（PRRSV）單克隆抗體的研制、特性及應用
一、PRRSV 概述
二、抗 PRRSV 單克隆抗體的研制流程
1. 抗原制備
1. 抗原結(jié)合特異性
1. 標記技術（用于檢測或治療）
1. 抗原制備
- 病毒抗原：選擇 PRRSV 經(jīng)典株（如 VR-2332、CH-1a）或流行株（如 NADC30-like、HP-PRRSV），在 Marc-145 細胞或 PK-15 細胞中增殖，經(jīng)滅活、純化后獲得全病毒抗原。
- 重組蛋白抗原：針對 PRRSV 的結(jié)構蛋白（如 GP5、M、N 蛋白）或非結(jié)構蛋白（如 nsp2），通過原核（大腸桿菌）或真核（昆蟲細胞、酵母）表達系統(tǒng)制備重組蛋白，優(yōu)點是抗原純度高、安全性好。
- 選用 6-8 周齡的 Balb/c 小鼠，通過腹腔注射抗原（輔以佐劑，如弗氏完全佐劑 / 不完全佐劑），免疫 3-4 次后檢測血清抗體效價，選取高效價小鼠進行加強免疫，3 天后取脾臟分離 B 淋巴細胞。
- 用聚乙二醇（PEG）誘導脾細胞與骨髓瘤細胞（如 SP2/0、NS0）融合，篩選出雜交瘤細胞。
- 通過間接 ELISA、免疫熒光（IFA） 或中和試驗篩選能分泌特異性抗 PRRSV 抗體的雜交瘤細胞，重點關注：
- 對 PRRSV 不同毒株的結(jié)合活性；
- 對病毒感染細胞的識別能力；
- 抗體的中和活性（能否抑制病毒與宿主細胞結(jié)合或復制）。
- 采用有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行單克隆化，確保單一抗體分泌。
- 通過小鼠腹腔注射（誘生腹水）或細胞培養(yǎng)（體外發(fā)酵罐）生產(chǎn)單克隆抗體，經(jīng) Protein A/G 親和層析或硫酸銨沉淀法純化。
1. 抗原結(jié)合特異性
- ELISA/IFA 檢測：驗證抗體與 PRRSV 不同毒株（如基因 1 型、基因 2 型）的結(jié)合能力，分析是否具有廣譜識別性；同時與其他豬病毒（如豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒等）進行交叉反應測試，確�？贵w特異性。
- 表位定位：通過突變抗原表位、多肽競爭實驗等方法，確定抗體識別的抗原表位（如 GP5 蛋白的高變區(qū)或保守區(qū)），明確其針對的抗原區(qū)域（線性表位或構象表位）。
- 中和活性：采用病毒中和試驗（VNT）測定抗體對 PRRSV 感染宿主細胞的抑制能力，中和效價（如 IC₅₀）是評估抗體抗病毒活性的關鍵指標。
- 抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）：檢測抗體是否能通過 Fc 段介導免疫細胞（如巨噬細胞）對病毒感染細胞的殺傷作用。
1. 標記技術（用于檢測或治療）
- 酶標記（HRP/AP）：通過碳二亞胺法（EDC）或戊二醛法將辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）與抗體偶聯(lián)，用于 ELISA、免疫組化（IHC）等檢測方法。
- 熒光標記（FITC/PE/APC）：利用異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）等熒光染料與抗體結(jié)合，適用于流式細胞術（FCM）、IFA 等熒光檢測。
- 生物素標記：通過 N - 羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化生物素與抗體氨基結(jié)合，結(jié)合鏈霉親和素 - 酶 / 熒光探針系統(tǒng)，放大檢測信號。
- 膠體金標記：用于免疫膠體金試紙條，通過調(diào)節(jié) pH 值使膠體金顆粒與抗體穩(wěn)定結(jié)合，形成可視化標記物。
- 固相包被（ELISA 板 / 試紙條）：
- 緩沖液選擇：常用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）或 PBS（pH 7.4），將抗體稀釋至最佳濃度（通過棋盤滴定確定），4℃包被過夜，確�？贵w以正確構象固定于固相載體。
- 封閉處理：包被后用牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉或明膠溶液封閉非特異性結(jié)合位點，降低背景信號。
- 側(cè)向流層析（試紙條）：
- 標記墊包被：將膠體金標記抗體噴涂于玻璃纖維膜，作為檢測探針；
- 硝酸纖維素膜（NC 膜）包被：檢測線（T 線）包被抗 PRRSV 另一表位的單克隆抗體（雙抗體夾心法），質(zhì)控線（C 線）包被羊抗鼠 IgG 抗體，確保試紙條有效性。
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- 開發(fā) ELISA 試劑盒、膠體金試紙條，用于 PRRSV 抗原（如 N 蛋白）或中和抗體的檢測，輔助臨床診斷和流行病學調(diào)查；
- 結(jié)合流式細胞術或免疫熒光，分析 PRRSV 感染細胞的抗原表達動態(tài)。
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- 作為工具抗體，用于 PRRSV 復制機制研究（如病毒與宿主細胞受體的結(jié)合位點分析）、抗原表位鑒定及疫苗免疫原性評估；
- 通過中和抗體篩選，確定 PRRSV 的中和表位，為新型疫苗（如亞單位疫苗、表位疫苗）設計提供靶點。
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- 高中和活性的單克隆抗體可作為被動免疫制劑，用于仔豬 PRRSV 感染的緊急干預，或與疫苗聯(lián)合使用增強保護效果；
- 通過基因工程改造（如人源化抗體）降低免疫原性，探索臨床治療潛力。
- PRRSV 的抗原變異性：基因 2 型毒株（如 NADC30-like）的 nsp2 蛋白存在大片段缺失，GP5 蛋白高變區(qū)易突變，導致單克隆抗體的廣譜性不足，需針對流行毒株動態(tài)優(yōu)化抗原選擇。
- 中和抗體的篩選效率：PRRSV 的中和表位有限且依賴構象，傳統(tǒng)雜交瘤技術篩選到高中和活性抗體的概率較低，可結(jié)合噬菌體展示技術或單細胞測序技術提高篩選效率。
- 標記包被的穩(wěn)定性：抗體標記后可能影響其親和力，需優(yōu)化標記條件（如標記物比例、反應時間），并通過穩(wěn)定性試驗（如 4℃、37℃加速老化）驗證試劑盒的保質(zhì)期。
- 基因工程抗體技術：利用噬菌體展示庫或轉(zhuǎn)基因動物（如小鼠、兔）制備全人源或高親和力單克隆抗體，減少異源抗體的免疫原性。
- 雙特異性抗體：設計同時識別 PRRSV 不同表位（如 GP5 和 M 蛋白）的雙抗，提高中和效率并降低病毒逃逸風險。
- 納米抗體（VHH 抗體）：從駱駝科動物中篩選針對 PRRSV 的納米抗體，其分子量小、穩(wěn)定性高，可通過原核表達大規(guī)模生產(chǎn)，適用于診斷和治療。
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