抗豬A型輪狀病毒（PoRV A）單克隆抗體制備方法及應(yīng)用場景

抗豬 A 型輪狀病毒（Porcine Rotavirus A, PoRV A）單克隆抗體在病毒檢測、致病機(jī)制研究及疫苗開發(fā)中具有重要價(jià)值。以下從毒株型號、抗體特性、制備方法、特異性參數(shù)及應(yīng)用場景等方面詳細(xì)說明相關(guān)參數(shù)：

豬 A 型輪狀病毒根據(jù) VP7 糖蛋白（G 型）和 VP4 蛋白酶敏感蛋白（P 型）分為不同血清型，常見毒株如下：

• VP7 糖蛋白： 
  • 構(gòu)成病毒外衣殼，含中和表位（Neutralization Epitope, NE） 和型特異性表位（Type-Specific Epitope），如 G5 型 VP7 的 D 區(qū)（氨基酸 240-280）為保守中和區(qū)。
• VP4 蛋白： 
  • 經(jīng)蛋白酶切割后形成 VP5和 VP8亞基，VP8 * 含宿主細(xì)胞受體結(jié)合域，是 P 型分型的關(guān)鍵抗原。

1. 雜交瘤細(xì)胞株構(gòu)建：

   • 免疫原：重組 VP7 蛋白（如 G5 型 VP7 的 1-300aa 片段，桿狀病毒表達(dá)后純化）或滅活病毒顆粒（OSU 株）。
   • 融合細(xì)胞：SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠（BALB/c）的脾細(xì)胞融合，通過間接 ELISA 篩選陽性克隆。
   • 抗體純化：Protein A 親和層析，純度＞98%，內(nèi)毒素＜0.05 EU/mg。

2. 特異性驗(yàn)證指標(biāo)：

   • 交叉反應(yīng)： 
     • 與豬 B 型輪狀病毒（PoRV B）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）等無交叉反應(yīng)（ELISA OD 值＜0.05）。
     • 與同屬人輪狀病毒（HRV）、牛輪狀病毒（BRV）交叉反應(yīng)率＜2%。
   • 中和活性：對同源毒株（如 G5P [7] OSU 株）的空斑減少率≥90%（抗體濃度 10 μg/mL）。

1. 雙抗體夾心 ELISA： 
   • 包被抗體：4G2 株單抗（5 μg/mL），檢測抗體：HRP 標(biāo)記的 6H9 株單抗（1:10000 稀釋），檢測限（LOD）=5 ng/mL PoRV 抗原。
2. 免疫熒光（IFA）： 
   • 抗體濃度：8 μg/mL，可識別感染 PoRV 的 MA104 細(xì)胞內(nèi)病毒抗原，熒光強(qiáng)度（MFI）＞1500。
3. 病毒中和試驗(yàn)（VNT）： 
   • 中和型單抗（如針對 VP7 的 4G2 株）在 1:256 稀釋時(shí)可完全抑制 OSU 株感染，IC₅₀測定值為 2.3 ng/mL。

• 疫苗效力評價(jià)：單抗可用于檢測免疫仔豬血清中的中和抗體滴度，評估 G5 型疫苗對同源 / 異源毒株的保護(hù)效果。
• 抗原變異監(jiān)測：通過單抗結(jié)合試驗(yàn)（Monoclonal Antibody Binding Assay, MABA）分析野外毒株 VP7/VP4 的抗原漂移，指導(dǎo)疫苗株更新。

1. 血清型特異性：由于 PoRV A 不同 G/P 型的 VP7/VP4 抗原差異顯著，建議根據(jù)目標(biāo)血清型（如 G5 或 G9）選擇對應(yīng)的單克隆抗體。
2. 交叉反應(yīng)控制：部分廣譜單抗可能與豬杯狀病毒（如諾如病毒）存在低水平交叉反應(yīng)，需通過陰性細(xì)胞裂解液吸附法排除干擾。
3. 應(yīng)用場景優(yōu)化： 
   • 檢測臨床樣品（如腹瀉糞便）時(shí)，建議使用針對 VP6 群特異性抗原的單抗（如泛 A 型單抗）進(jìn)行初篩，再用型特異性單抗分型。
   • 中和試驗(yàn)需在含胰酶（1 μg/mL）的培養(yǎng)基中進(jìn)行，以模擬腸道蛋白酶對 VP4 的激活作用。

如需針對特定地區(qū)流行毒株的單抗，建議結(jié)合當(dāng)?shù)?PoRV G/P 型監(jiān)測數(shù)據(jù)（如通過 RT-PCR 分型）選擇匹配的抗體株，并在使用前通過交叉反應(yīng)試驗(yàn)驗(yàn)證特異性。