抗豬肺炎支原體（Mhp）單克隆抗體的抗體特性、制備方法及特異性

抗豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）單克隆抗體的相關(guān)參數(shù)需結(jié)合其病原特性、制備工藝及應(yīng)用場景確定，以下從毒株型號、抗體特性、制備方法及特異性等方面詳細(xì)介紹：

 

一、豬肺炎支原體常用毒株型號

豬肺炎支原體是引起豬支原體肺炎（喘氣�。┑牟≡�，其毒株型號根據(jù)分離地區(qū)和時間不同而有所差異，常見毒株如下：

 

國際標(biāo)準(zhǔn)毒株： 

J 株：最早從美國病豬中分離，是研究和疫苗生產(chǎn)的經(jīng)典毒株，基因組序列已公布（GenBank 登錄號：CP006945）。

232 株：美國分離株，常用于疫苗效力評價和抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)品。

中國流行毒株： 

168 株：中國早期分離的強(qiáng)毒株，用于國內(nèi)疫苗（如豬肺炎支原體滅活疫苗）的生產(chǎn)。

HN06 株、SH 株：近年國內(nèi)流行的高毒力變異株，其黏附蛋白（如 P97、P102）抗原性與經(jīng)典毒株存在差異。

其他地區(qū)毒株：如歐洲的 7448 株、澳大利亞的 AP 株等，不同毒株的表面蛋白（如 P97、P65、P116）氨基酸序列同源性約 85%~95%，但部分高變區(qū)可能影響抗體識別。
 

二、抗豬肺炎支原體單克隆抗體的特性

抗體類型與亞型 

單克隆抗體（mAb）多為 IgG 類，常見亞型為 IgG1 或 IgG2a（取決于小鼠品系，如 BALB/c 小鼠制備的抗體），少數(shù)為 IgM（初篩階段可能出現(xiàn)）。

抗體效價與親和力 

效價：間接 ELISA 檢測中，腹水抗體效價通常≥1×10⁶，細(xì)胞培養(yǎng)上清效價≥1×10⁴，高親和力抗體可通過生物層干涉技術(shù)（BLI）或表面等離子共振（SPR）測定，KD 值可達(dá) 10⁻⁹~10⁻¹¹ M。
 

三、抗豬肺炎支原體單克隆抗體制備方法及關(guān)鍵參數(shù)

（一）制備流程關(guān)鍵步驟

抗原制備 

天然抗原：培養(yǎng) Mhp 菌株（如 J 株、168 株），通過超聲波破碎或凍融法釋放抗原，經(jīng)超離心和層析純化獲得全菌抗原或表面蛋白（如 P97、P65）。

重組抗原：利用原核（如 E. coli）或真核（如畢赤酵母）表達(dá)系統(tǒng)制備重組 P97 蛋白（尤其是 C 端高保守區(qū) P97ⁿⁱᵇ），純度需≥95%（SDS-PAGE 檢測）。

動物免疫 

免疫方案：6~8 周齡 BALB/c 小鼠，皮下或腹腔注射抗原（50~100 μg / 只），佐劑（弗氏完全佐劑 / 不完全佐劑）混合，免疫周期 4~6 周，末次免疫后 3 天取脾細(xì)胞。

雜交瘤細(xì)胞制備 

脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞（如 SP2/0）按 5:1 比例融合，PEG 1500（50% 濃度）誘導(dǎo)融合，融合效率約 10%~20%，需在 HAT 培養(yǎng)基中篩選雜交瘤細(xì)胞。

抗體篩選 

雙篩選策略： 

ELISA 篩選：以 Mhp 抗原包被，檢測培養(yǎng)上清與 J 株、168 株等毒株的結(jié)合活性。

免疫熒光（IFA）或 Western blot：驗證抗體對 Mhp 天然蛋白的識別能力，排除識別培養(yǎng)基雜質(zhì)的假陽性。

中和試驗（可選）：部分研究通過 Mhp 黏附抑制試驗篩選能阻斷細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞的中和抗體（如抑制 P97 與豬氣管上皮細(xì)胞結(jié)合）。

克隆化與抗體生產(chǎn) 

有限稀釋法克隆化 2~3 次，確保單克隆性；腹水誘生法（腹腔注射 Pristane 預(yù)處理小鼠）可獲得高濃度抗體（1~10 mg/mL），細(xì)胞培養(yǎng)法適用于大規(guī)模純化。

（二）制備關(guān)鍵參數(shù)

抗原純度：重組 P97 蛋白需通過 Ni-NTA 層析和凝膠過濾純化，內(nèi)毒素含量＜0.1 EU/μg（鱟試劑檢測），避免免疫反應(yīng)干擾。

融合后篩選陽性率：初次篩選中，陽性雜交瘤細(xì)胞比例通常＜5%，需通過多輪克隆化提高穩(wěn)定性。
 

四、抗豬肺炎支原體單克隆抗體的特異性

抗原特異性 

種屬特異性：理想抗體應(yīng)僅識別 Mhp，與其他豬支原體（如豬鼻支原體、豬關(guān)節(jié)炎支原體）無交叉反應(yīng)，可通過交叉 ELISA 驗證：與其他支原體的交叉反應(yīng)率＜5%。

毒株廣譜性：針對 P97 等保守蛋白的抗體需能識別 J 株、168 株、HN06 株等流行毒株，ELISA 結(jié)合活性差異≤20%。

表位特異性 

中和表位：靶向 P97ⁿⁱᵇ結(jié)構(gòu)域（如氨基酸殘基 459~516）的抗體具有黏附抑制活性，中和效價（抑制 50% 黏附的抗體濃度）＜10 μg/mL。

非中和表位：靶向 P65、P116 等表面蛋白的抗體常用于診斷（如 ELISA、免疫組化），但無中和功能。

應(yīng)用場景特異性 

診斷用抗體：需對 Mhp 抗原具有高敏感性（檢測限＜10 ng/mL），且能區(qū)分活疫苗株（如 168 株）與野毒株（如 HN06 株）。

治療用抗體：需兼具高中和活性和低免疫原性，可通過抗體人源化改造降低異種免疫反應(yīng)。
 

五、典型單克隆抗體實例（參考研究數(shù)據(jù)）

抗體編號靶向抗原亞型中和活性（黏附抑制率）交叉反應(yīng)應(yīng)用

4B7 P97ⁿⁱᵇ（C 端） IgG1 85%（10 μg/mL） 與豬鼻支原體＜1% 中和治療、診斷

2F5 全菌膜蛋白 IgG2a 無 與 Mhp 各毒株結(jié)合率＞95% 免疫組化（肺組織檢測）

7C11 重組 P65 蛋白 IgG1 無 與其他支原體交叉率＜3% ELISA 檢測抗原捕獲
 

六、注意事項

毒株變異影響：近年流行的 Mhp 高毒力株（如中國 HN06 株）在 P97 基因的可變區(qū)（VR1、VR2）存在氨基酸突變，制備的抗體需驗證對變異株的識別能力，避免診斷假陰性。

抗體應(yīng)用優(yōu)化：用于豬群檢測時，需考慮豬血清中天然抗體的干擾（如使用競爭 ELISA 法）；治療用抗體需通過豬攻毒實驗驗證保護(hù)效果（如降低肺病變評分）。

如需更具體的參數(shù)，可參考《Veterinary Microbiology》等期刊中 Mhp 單克隆抗體制備的研究文獻(xiàn)，或咨詢商業(yè)抗體供應(yīng)商（如 VMRD、Biosera）的技術(shù)資料。